补阳还五汤通过miR-148a-3p抑制大鼠星形胶质细胞凋亡而减轻脑缺血再灌注损伤.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1431-1439杂志网址：http:/补阳还五汤通过miR-148a-3p抑制大鼠星形胶质细胞凋亡而减轻脑缺血再灌注损伤*田甜1，蔡国英1，2，叶佳蓓3，单玉栋4，周晓红1，郭书翰5，高维娟1（1河北中医药大学，河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091；2承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；3河北中医药大学第一附属医院针灸科，河北 石家庄 050013；4河北中医药大学附属河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061012；5河北中医药大学，河北 石家庄 050200）摘要 目的：探究补阳还五汤是否通过激活微小RNA-148a-3p（miR-148a-3p）靶向调控胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）而抑制大鼠氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）星形胶质细胞凋亡。方法：取对数生长期的大鼠星形胶质细胞系CTX TNA2，随机分为5组：空白对照组（CON组）、模型组（OGD/R组）、补阳还五汤含药血清（BYHWDS）组、miR-148a-3p抑制物组（inhibitor组）和BYHWDS+inhibitor组，每组每种检测重复3次。除CON组外，其余各组氧糖剥夺6 h后复氧复糖24 h，并于复氧复糖的同时给予相应药物处理（但转染于造模前操作）。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；MTS法检测各组细胞活力变化；qRT-PCR检测miR-148a-3p、GFAP mRNA和caspase-3 mRNA的表达水平；Western blot检测GFAP、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9和cleaved caspase-9蛋白水平；annexin V-FITC/PI染色检测CTX TNA2细胞的凋亡情况；免疫荧光双染观察GFAP、caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。结果：与CON组相比，OGD/R组和inhibitor组的细胞皱缩，突起严重萎缩、变形，细胞碎片增多，细胞活力显著降低（P0.01），miR-148a-3p表达水平降低（P0.01），GFAP和caspase-3的mRNA表达水平均显著升高（P0.01），GFAP蛋白表达水平，cleaved caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-9/caspase-9比值，以及细胞凋亡水平均显著升高（P0.05）。与OGD/R组和inhibitor组相比，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组细胞形态较损伤后有所恢复，突起萎缩减轻，连接有所增加，细胞活力显著升高（P0.01），miR-148a-3p表达水平升高（P0.01），GFAP和caspase-3的 mRNA表达水平均显著降低（P0.01），GFAP蛋白表达水平，cleaved caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-9/caspase-9比值，以及细胞凋亡水平均显著降低（P0.05）。结论：补阳还五汤能上调miR-148a-3p表达而调低靶基因GFAP，从而抑制OGD/R大鼠CTX TNA2细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤，发挥神经保护作用。关键词 补阳还五汤；微小RNA-148a-3p；胶质细胞原纤维酸性蛋白；星形胶质细胞；细胞凋亡；脑缺血再灌注损伤中图分类号 R743.3；R364.1；R285.5 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.011Buyang-Huanwu decoction alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting rat astrocyte apoptosis through miR-148a-3pTIAN Tian1，CAI Guoying1，2，YE Jiabei3，SHAN Yudong4，ZHOU Xiaohong1，GUO Shuhan5，GAO Weijuan1（1Hebei University of Chinese Medicine，Heibei Key Laboratory of Chinese Medicine Research on Cardio-cerebrovascular Disease，Shijiazhuang 050091，China；2Department of Pathophysiology，Chengde Medical College，Chengde 067000，China；3Department of Acupuncture and Moxibustion，the First Affiliated Hospital of Hebei College of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050013，China；4Hebei Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Hebei College of Traditional Chinese Medicine，Cangzhou 061012，China；5Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To explore the mechanism of Buyang-Huanwu decoction in alleviating cerebral ischemia-re文章编号 1000-4718（2023）08-1431-09 收稿日期 2023-04-12 修回日期 2023-07-08*基金项目 中央引导地方科技发展资金（No.206Z7706G）；河北省科技研发平台与新型研发机构建设专项（No.20567626H）；河北省属高校基本科研业务费基础研究专项（No.JCYJ2022009）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1431perfusion injury.METHODS：Rat astrocyte CTX TNA2 cells at the logarithmic growth stage were randomly divided into 5 groups：blank control group（CON group），model group （oxygen-glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R）group，Buyang-Huanwu decoction-medicated serum（BYHWDS）group，miR-148a-3p inhibitor group（inhibitor group），and BYHWDS+inhibitor group.All experiments were conducted three times with three replicates.Apart from the cells in CON group，the cells in the other groups were subjected to OGD for 6 h and reoxygenation for 24 h，and were then treated with the drugs at the same time of reoxygenation（transfection was performed before modeling）.Cell morphology was observed by inverted phase-contrast microscopy and viability was measured by MTS method.The expression of microRNA-148a-3p（miR-148a-3p），glial fibrillary acidic protein（GFAP）mRNA and caspase-3 mRNA was measured by qRT-PCR，and the protein levels of GFAP，Bcl-2，Bax，caspase-3，cleaved caspase-3，caspase-9 and cleaved caspase-9 were assessed by Western blot.Apoptosis was measured using an annexin V-FITC/PI kit.The expression of GFAP，caspase-3，Bcl-2 and Bax was also evaluated by immunofluorescence double-staining.RESULTS：Compared with CON group，the cells in OGD/R and inhibitor groups were observed to be shrunken and deformed，with increased cell debris and significantly reduced viability（P0.01）.The expression of miR-148a-3p was significantly decreased（P0.01），while the mRNA levels of GFAP and caspase-3 were significantly increased（P0.01）.The protein expression of GFAP，the cleaved caspase-3/caspase-3，Bax/Bcl-2 and cleaved caspase-9/caspase-9 ratios，and the apoptosis level were significantly increased（P0.05）.Compared with OGD/R and inhibitor groups，the cell morphology of BYHWDS and BYHWDS+inhibitor groups recovered after injury，with reduced atrophy，increased connections，and significantly increased cell viability（P0.01）.The expression of miR-148a-3p was significantly increased（P0.01），and the mRNA levels of GFAP and caspase-3 were significantly decreased（P0.01）.The protein expression of GFAP and apoptosis-related proteins，and the apoptosis level were significantly decreased（P0.05）.CONCLUSION：Buyang-Huanwu decoction activates miR-148a-3p to reduce the expression of its target gene GFAP，thus reducing apoptosis of rat astrocyte CTX TNA2 cells with OGD/R，alleviating cerebral ischemia-reperfusion injury，and playing a neuroprotective role.KEY WORDS Buyang-Huanwu decoction；microRNA-148a-3p；glial fibrillary acidic protein；astrocytes；apoptosis；cerebral ischemia-reperfusion injury缺血性脑卒中是临床上常见的脑血管疾病，在其治疗过程中常常发生脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。细胞凋亡等多种病理过程参与了CIRI。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类长度为2126个核苷酸的内源性非编码RNA，主要通过与靶基因 mRNA 的 3-非翻译区结合，抑制转录后翻译来调控靶基因1。miRNA在脑组织中表达较高，可能影响着神经元的分化、发育2。越来越多研究表明，miRNA与细胞的凋亡和增殖相关。星形胶质细胞是中枢神经系统内含量丰富的神经胶质细胞，生理情况下，对神经元发挥营养支持的作用，参与神经元的糖、脂肪、体液代谢过程和血流调节；在缺血性脑卒中发生时，星形胶质细胞可以通过自身生物能量和线粒体动力学的变化为损伤神经元提供能量支持。胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞的特异性标志物，具有维护星形胶质细胞形态稳定、调节突触功能、参与细胞迁移和运动、参与血脑屏障形成等功能。补阳还五汤（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）被广泛应用于治疗缺血性脑卒中，能益气、活血、通络。课题组前期转录组测序证明GFAP 是 CIRI 中的显著差异表达基因之一，且以GFAP 为靶点，预测出上游的 miR-148a-3p，并证实miR-148a-3p 和 GFAP 存在结合位点，而 BYHWD 是否能通过这个机制发挥神经保护作用还未知。本课题组前期研究显示，BYHWD能通过影响细胞凋亡3、自噬4等机制来减轻 CIRI，而 BYHWD 是否通过调控 miRNA 抑制凋亡而发挥神经保护作用还未清楚。本研究通过建立氧糖剥夺/复氧复糖（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）的 CTX TNA2细胞（大鼠脑I型星形胶质细胞）模型，体外模拟神经元缺血再灌注损伤环境，从离体水平上观察BYHWD 是否通过调控 miR-148a-3p、调节靶基因GFAP 而抑制大鼠星形胶质细胞凋亡，从而减轻CIRI，以探讨BYHWD在减轻CIRI中新的分子机制。材料和方法1实验动物与细胞本实验采用SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，68周龄，质量为230240 g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。大鼠在河北中医药大学实验1432动物中心适应性生存34 d，每天光照时间为7：0019：00，造模前均保证食物与水的供应。本研究动物实验所有操作程序已通过河北中医药大学伦理委员会审核批准（审批号：DWLL202302003）。CTX TNA2细胞株购自上海赛百慷生物技术股份有限公司。2主要材料与试剂黄芪120 g，赤芍5 g，当归6 g，红花、桃仁、川芎和地龙各 3 g，均购自北京同仁堂有限公司；DMEM高糖培养液、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和无糖培养液（Gibco）；OPTI-MEM培养液（BioExplorer）；胎牛血清（本元生物科技有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒和SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）购自TaKaRa；Trizol 试 剂（Invitrogen）；MTS 试 剂 盒（Promega）；miR-148a-3p inhibitor由苏州吉玛基因有限公司构建；All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit、rno-miR-148a-3p引物和大鼠U6引物（GeneCopoeia）；annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（翌圣生物科技股份有限公司）；12%SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒、RIPA裂解液（强）、抗荧光淬灭封片液（含DAPI）、Cy3标记的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技术有限公司）；-actin引物、GFAP引物、caspase-3引物和HRP标记的山羊抗兔IgG（赛维尔生物科技有限公司）；caspase-3小鼠单克隆抗体（Western blot用；Abcam）；GFAP兔多克隆抗体（Western blot用）、caspase-9/p35/p10兔多克隆抗体、caspase-3/p17/p19兔多克隆抗体（荧光抗）和-actin小鼠单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；Bcl-2 小鼠单克隆抗体、Bax 兔多克隆抗体和GFAP小鼠单克隆抗体（荧光抗）购自ImmunoWay；HRP标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。3主要仪器与设备Fusion FX5 Spectra 多功能成像系统（Vilber）；Varioskan LUX型多功能微孔板读数仪、3111型二氧化碳培养箱、3131型三气培养箱和QuantStudio 5实时定量 PCR 仪（Thermo Fisher Scientific）；Primovert型倒置相差显微镜（Carl Zeiss）；正置荧光显微镜（OLYMPUS）；T20型细胞计数仪、恒压电泳仪、转膜仪和 CFX Connect 实时荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad）；SW-CJ-ID型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；5702型低温离心机（Eppendorf）。4主要方法4.1细胞培养将CTX TNA2细胞复苏后接种于无菌培养瓶中，加入含有10%胎牛血清和1%青-链霉素混合液的DMEM高糖培养液，将其置于37、5%CO2和70%80%湿度的细胞培养箱中培养，选用生长旺盛时的对数期细胞进行实验。4.2细胞分组和干预取对数生长期的大鼠CTX TNA2细胞，随机分为5组，接种于6孔板中：空白对照组（CON组）、模型组（OGD/R组）、BYHWD含药血清（BYHWD-medicated serum，BYHWDS）组、miR-148a-3p抑制物组（inhibitor组）和BYHWDS+inhibitor组。每组细胞接种至少3个孔，为3次生物学重复，除CON组外，其余各组氧糖剥夺6 h后复氧复糖24 h，并于复氧复糖的同时给予相应药物处理（但转染于造模前操作），对比观察CTX TNA2细胞的活力和凋亡情况。4.3细胞转染将对数生长期的CTX TNA2细胞种于6孔板后，每孔3105细胞、2 mL培养液放于培养箱中过夜，待细胞密度长至 60%80%进行转染操作，按照说明书配好各孔所需的GP-transfect-Mate转染试剂-培养液复合物和RNA oligo培养液复合物，使用 OPTI-MEM 培养液配制。混匀为最终转染复合物，室温静置20 min，静置时给细胞换成1.6 mL无抗生素新鲜完全培养液；将最终混合转染复合物 0.4 mL加到细胞中，终体系为2 mL，轻轻晃动使复合物均匀分布；放回培养箱中静置6 h，换成完全培养液，24 h检测RNA和蛋白表达。4.4 细胞OGD/R模型的建立 选择生长状态较好、处于对数生长期的 CTX TNA2细胞，倒去旧的培养液，PBS润洗细胞2次，吸尽PBS，加入DMEM无糖培养液模拟缺血状态，迅速置于37 三气培养箱（含94%N2+5%CO2+1%O2）中，模拟细胞的缺氧缺糖状态，参照文献中的方法5。缺氧缺糖6 h后，倒去无糖培养液，用PBS润洗一遍细胞，加入完全培养液常规培养 24 h，即细胞复氧复糖 24 h，模拟再灌注过程。CON组细胞不做任何处理。4.5BYHWDS 的制备参照文献方法5，BYHWD饮片用纯水熬制，每副药浓缩成水煎液100 mL（1 mL约含1.43 g生药），取30只体质量230240 g的雄性SD 大鼠，其中 20 只以 BYHWD（14.8 g kg1 d1）灌胃，另外10只以2 mL/d的生理盐水灌胃，连续7 d，最后一次灌胃后禁食禁水2 h，在无菌环境中从腹主动脉取血收集到促凝管中，全血常温静置15 min，4、1 200g离心30 min，吸取上清液，56 水浴30 min灭活补体，经0.22 m滤膜过滤除菌后存于80 冰箱。可分装成每管2 mL，方便取用，配好的含药血清完全培养液也经过0.22 m过滤除菌后使用，现用现配。4.6倒置相差显微镜观察细胞形态变化前期预1433实验得出5%的BYHWDS对OGD/R的CTX TNA2细胞具有最佳保护作用，对各组细胞均进行倒置相差显微镜观察形态和状态，每个皿采集20倍的3个视野的图像并留存。4.7MTS法检测各组细胞活力将对数生长期的CTX TNA2细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔7103个（100 L培养液），每组做3个复孔，实验重复3次。各组细胞转染和造模处理完毕后，根据试剂盒说明书，向每孔加入20 L的MTS试剂，将培养板放入 37、5%CO2培养箱中孵育 50 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度（absorbance，A）。按照下述公式进行计算：细胞相对活力（%）=（A实验组A空白组）/（A对照组A空白组）100%。4.8Western blot 检测 GFAP、Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9和cleaved caspase-9蛋白水平各组细胞提蛋白，细胞弃去上清，预冷的 PBS清洗后加1 mL PBS将细胞刮下，4、5 500g离心4 min，吸去上清液，加入裂解液，使细胞充分裂解至澄清，冰上静置 15 min，4、13 000g离心 15 min，提取上清液后取1020 L，按照BCA试剂盒说明书进行蛋白浓度测定。计算好将浓度调成一致，加入4上样缓冲液和RIPA震荡，100 热变性5 min。每孔20 g蛋白样品，SDS-PAGE浓缩胶75 V 40 min，分离胶 120 V 1 h 40 min，湿转 200 mA 恒流 1 h 至 PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h。孵育抗（兔抗 GFAP、小鼠抗 caspase-3 和小鼠抗cleaved caspase-3 抗体，1 5 000；兔抗 Bax 和小鼠抗Bcl-2，1 1 000；兔抗caspase-9和cleaved caspase-9抗体，1 500；小鼠抗-actin抗体，1 10 000），4 孵育过夜。0.1%PBST依次洗膜15、15和10 min，加入对应种属的抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1 3 000；山羊抗小鼠 IgG，1 15 000）。室温孵育 1 h，0.1%PBST洗膜10 min3次，进行ECL显影。所有数据采用VisionCapt 16.12软件进行灰度值分析。4.9qRT-PCR 检测 GFAP mRNA、caspase-3 mRNA和miR-148a-3p的表达水平使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA并进行纯度和浓度检测，按照试剂盒说明书进行逆转录和扩增。（1）mRNA逆转录反应条件为：37 15 min，85 5 s。扩增反应条件为：95 30 s；95 5 s，60 34 s，40个循环；95 15 s，60 1 min，95 15 s。反应体系（20 L）：cDNA 2 L，Tag 10 L，正、反向引物各 0.8 L，Dye 0.4 L，ddH2O 6 L。（2）miRNA逆转录反应条件为：37 60 min，85 5 min。扩增反应条件为：95 10 min；95 10 s，60 20 s，72 10 s，40个循环；72 5 min，60 5 s。反应体系（20 L）：cDNA 2 L，2 All-in-One qPCR Mix 10 L，All-in-One miR-148a-3p primer 2 L，universal adaptor primer 2 L，ddH2O 4 L。采集循环退火后的荧光信号。引物序列见表1。分别以-actin和U6为内参照，统计各组Ct值，采用2Ct法进行数据分析。4.10annexin V-FITC/PI 试剂盒检测细胞凋亡情况用直径14 mm圆形细胞爬片覆盖24孔板，其上接种对数生长期的CTX TNA2细胞（每孔4104个细胞，500 L培养液），除原有分组外，设立阴性对照组（不加FITC和PI）、单染FITC组和单染PI组，每组设置3个复孔，放于37、5%CO2培养箱培养，待细胞密度长至60%80%进行转染操作，转染6 h后进行OGD/R造模操作，并于复氧复糖的同时给予相应药物处理。根据试剂盒说明书操作，弃去上清液后用PBS漂洗细胞2次；在500 L缓冲液中加入5 L annexin V-FITC 和 10 L PI 染色试剂（此为每孔的用量，计算好总共所需的量配制复合物），轻轻混匀，避光、室温反应1015 min；取10 L上述溶液滴于载玻片表面，将盖玻片倒置于载玻片上，样品在1 h内用荧光显微镜观察拍照：annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。每张片子随机选取3个视野，用ImageJ 1.51软件分析平均荧光强度。4.11免疫荧光双染观察GFAP、caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况细胞爬片、转染、造模给药操作同上，弃去上清液后用PBS漂洗2次，每次5 min，4%多聚甲醛4 固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；用0.3%Triton X-100 室温破膜 15 min，PBS 漂洗 3 次，每次5 min；QuickBlock免疫染色封闭液室温封闭15 min，加入兔抗caspase-3单克隆抗体（1 250）和小鼠抗GFAP抗体（1 200）混合液，或小鼠抗Bcl-2抗体和兔抗Bax抗体（均1 200）混合液覆盖于玻片上，避光表1引物序列Table 1.Primer sequencesName-actinGFAPCaspase-3miR-148a-3pPrimer sequence（5-3）F：TGCTATGTTGCCCTAGACTTCGR：GTTGGCATAGAGGTCTTTACGGF：AGTCGGCGAGTTACCAGGAGR：TTAATGACCTCGCCATCCCGF：CTGGACTGCGGTATTGAGACAR：CGGGTGCGGTAGAGTAAGCF：CAAAGUUCUGUAGUGCACUGAProduct（bp）240307103F：forward；R：reverse.1434于4 冰箱过夜。次日用PBS漂洗3次，每次5 min，随后加入Cy3标记的山羊抗兔IgG和Alex标记的山羊抗小鼠IgG荧光抗（均1 500）混合液，避光室温孵育 1 h后取出；用 PBS 漂洗 3次，每次 5 min，加入10 L含DAPI的封片剂封片。在荧光显微镜下观察并拍照：Cy3呈红光，Alex呈绿光，DAPI染核呈蓝色。每张片子随机选取3个视野，使用ImageJ 1.51软件分析处理，计算平均荧光强度。5统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用均数标准差（meanSD）表示。具正态性和方差齐性者，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用 Tukey 法；不具正态性和方差齐性者，采用 Kruskal-Wallis H检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1BYHWDS对CTX TNA2细胞形态的影响测量不同浓度 BYHWDS 作用后正常和 OGD/R模型CTX TNA2细胞的活力，发现5%BYHWDS使细胞活力增强，过高浓度则对细胞产生损伤作用，5%BYHWDS对OGD/R模型CTX TNA2细胞的保护作用最好。倒置相差显微镜观察显示，CON组细胞形态饱满有活力，膜边界清晰锐利，呈贴壁性生长；与CON 组相比，OGD/R 组和 inhibitor 组的细胞明显皱缩，触角变多变细，贴壁不紧有脱落现象，突起严重萎缩、变形，边界模糊，细胞碎片增多；与OGD/R组相比，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组细胞形态较损伤后有所恢复，突起萎缩减轻，连接有所增加，见图1。2BYHWDS对OGD/R模型CTX TNA2细胞活力的影响MTS实验结果显示，相较于CON组，OGD/R组和inhibitor 组细胞活力显著降低（P0.01）；相较于OGD/R组和inhibitor组，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组细胞活力显著升高（P0.01），见图2。3各组 CTX TNA2 细胞 GFAP、caspase-3、Bax、Bcl-2和caspase-9的蛋白表达水平Western blot 结果显示，与 CON 组相比，OGD/R组和inhibitor组GFAP的蛋白表达水平、cleaved caspase-3/caspase-3 比值、Bax/Bcl-2 比值、cleaved caspase-9/caspase-9比值均显著升高（P0.05）；与OGD/R组和inhibitor组相比，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组GFAP和凋亡相关蛋白的表达水平均显著降低（P0.05），见图3。4各组细胞miR-148a-3p、GFAP和caspase-3的基因表达水平qRT-PCR 结果显示，与 CON 组相比，OGD/R 组和inhibitor组miR-148a-3p的表达水平显著降低（P0.01），GFAP和caspase-3的mRNA表达水平均显著升 高（P0.01）；与 OGD/R 组 和 inhibitor 组 相 比，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组miR-148a-3p的表达水平显著升高（P0.01），GFAP 和 caspase-3 的mRNA表达水平均显著降低（P0.01），见图4。Figure 1.Effects of Buyang-Huanwu decoction-medicated serum（BYHWDS）on the morphology of CTX TNA2 cells（scale bar=100 m）.图1补阳还五汤含药血清对CTX TNA2细胞形态的影响Figure 2.Effects of Buyang-Huanwu decoction-medicated serum（BYHWDS）on the viability of CTX TNA2 cells with OGD/R.MeanSD.n=3.*P0.01 vs control（CON）group；P0.01 vs OGD/R or inhibitor group.图2补阳还五汤含药血清对OGD/R模型CTX TNA2细胞活力的影响14355各组CTX TNA2细胞凋亡情况annexin V-FITC/PI 染色结果显示，与 CON 组相比，OGD/R组和inhibitor组FITC凋亡平均荧光强度显著升高（P0.01）；与OGD/R组和inhibitor组相比，BYHWDS 组和 BYHWDS+inhibitor 组 FITC 凋亡平均荧光强度显著降低（P0.01），见图5。6BYHWDS 对 OGD/R 模型 CTX TNA2 细胞中GFAP和caspase-3平均荧光强度的影响免疫荧光双标染色法结果显示，与CON组相比，OGD/R 组和 inhibitor 组 GFAP 和 caspase-3 平均荧光强度均显著升高（P0.01）；与 OGD/R 组和 inhibitor组相比，BYHWDS 组和 BYHWDS+inhibitor 组 GFAP和 caspase-3 平均荧光强度均显著降低（P0.01），见图6。Figure 3.Protein expression of GFAP，caspase-3，Bax，Bcl-2 and caspase-9 in CTX TNA2 cells of different groups.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs CON group；P0.05，P0.01 vs OGD/R or inhibitor group.图3各组CTX TNA2细胞GFAP、caspase-3、Bax、Bcl-2和caspase-9的蛋白表达水平Figure 4.The expression of miR-148a-3p（A），GFAP mRNA（B）and caspase-3 mRNA（C）in CTX TNA2 cells of different groups.MeanSD.n=3.*P0.01 vs CON group；P0.01 vs OGD/R or inhibitor group.图4各组CTX TNA2细胞miR-148a-3p、GFAP mRNA和caspase-3 mRNA的表达水平14367BYHWDS 对 OGD/R 模型 CTX TNA2 细胞中Bcl-2和Bax平均荧光强度的影响免疫荧光双标染色法结果显示，与CON组相比，OGD/R组和inhibitor组Bax/Bcl-2平均荧光强度比值均显著升高（P0.01）；与 OGD/R 组和 inhibitor组相比，BYHWDS组和BYHWDS+inhibitor组Bax/Bcl-2平均荧光强度比值均显著降低（P0.01），见图7。讨论缺血性脑卒中是影响人类健康的常见病和多发病，其首选的治疗方式为溶栓，通常是药物溶栓或者手术介入溶栓。恢复脑血流再灌注和拯救缺血半暗带的神经元对缺血性脑卒中患者的预后至关重要，但缺血区血流恢复常造成二次损伤，即CIRI。自由基过度生成、氧化应激、钙超载、炎症反应、细胞凋亡等多种机制参与了CIRI。BYHWD是治疗缺血性脑卒中的经典方剂。现代药理学研究表明，BYHWD 中黄芪可抗血小板聚集、清除氧自由基；桃仁可抗凝血、提升血管活性；川芎能抗血栓、加速氧自由基的清除；赤芍能增加cAMP水平、抑制TXB2合成、抑制血小板聚集6；地龙中的蚓激酶能很好地水解血纤溶酶的底物，对纤维蛋白有特殊亲和力，抗凝又不影响止血。但BYHWD治疗CIRI的具体分子机制还未被阐明。本研究中，Figure 5.Apoptosis of CTX TNA2 cells in different groups measured using an annexin V-FITC（green）/PI（red）kit（scale bar=100 m）.MeanSD.n=3.*P0.01 vs CON group；P0.01 vs OGD/R or inhibitor group.图5annexin V-FITC/PI试剂盒检测各组CTX TNA2细胞凋亡情况Figure 6.Effect of Buyang-Huanwu decoction-medicated serum（BYHWDS）on mean fluorescence intensity of GFAP（green）and caspase-3（red）in CTX TNA2 cells with OGD/R（scale bar=100 m）.Blue fluorescence indicated DAPI（nuclei）.MeanSD.n=3.*P0.01 vs CON group；P0.01 vs OGD/R group or inhibitor group.图6补阳还五汤含药血清对OGD/R模型CTX TNA2细胞GFAP和caspase-3平均荧光强度的影响1437我们