mRNA试剂盒.doc

mRNA试剂盒使用步骤
1. 将RNA放到一个新EP管中，并用无RNase的水或者DEPC水添加至200μL。再向EP管中加入200μLmRNA Binding Buffer，使用涡旋仪混合均匀。注意：如果是使用总RNA，则最多使用RNA的量为1mg。
2. 将RNA混合液转入一个装有50mg oligo（dT）-cellulose 的EP管中并用涡旋仪混合均匀。然后放入70℃水浴3min。
3. 将（2）中的样品放在室温下（20-30℃）使用涡旋仪混合均匀30min（或者每隔5min使用涡旋仪混匀一下）。
（实际操作时：把样品放在恒温振荡器中600r/min，每个5min用旋涡仪振荡一次。）
4. 将（3）中的匀浆放入一个空的spin-column中，spin-column放在试剂盒中的离心管（collection-tube）中。室温下1000g离心1min。弃滤液。
（匀浆可以用枪头拨入spin-column管中）
5. 将spin-column放在（4）中离心管中，加入500μL mRNA wash buffer。用枪头吹打几次混匀，室温下1000g离心1min。弃滤液。
（静置了一会儿）
6. 将spin-column放到一个2mL EP管中。加入400μL mRNA Elution buffer（70℃预热）并用枪头吹打使沉淀分散均匀。离心。并将滤液转到一个新的1.5mlEP管中，再加一下次mRNA Elution buffer（70℃预热）于spin-column 中混合均匀，离心到第一次相同的2ml EP管中。
7. 两次的洗脱液混合，测量其体积。加入1/10体积的3 M NaAc（pH=5.2）混匀，然后加等体积的异丙醇，涡旋混匀。放 - 20℃静置至少30min。
实际操作时：加650μL混合液于1.5mlEP管中（用枪头将余液吸干净时避免碰到沉淀。）
8. 至少12000g 4℃ 离心20min，弃上清。用80%的预冷乙醇洗涤RNA。用涡旋仪混匀，然后不超过7500g 5min 4℃。
9. 弃上清，干燥沉淀5min 或使用吸水纸将液体吸干。
10. 用无RNase的水或者DEPC水溶解沉淀。（10μL/100mg tissue）。
（加10μL DEPC水）

反转录
mRNA 8μL
dNTP 1μL 65℃ 5min 然后迅速放在冰上。
oligo dT 1μL 注：（上述处理模板RNA变性，提高反转录效率）
10μL

上述产物10μL 然后放在pcr仪中
5 x PrimerScriptⅡBuffer 4μL 45℃ 30min
RNase Inhibitor 0.5μL 99℃ 5min
PrimerScript ⅡRTase 1μL 5℃ 5min
H2O 4.5μL
20μL