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分子标记辅助育种技术
第一节　
分子标记的类型和作用原理

v 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。
v 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。
v 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。
v 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。
v 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。
v 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。

1、 形态标记
v 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。
v 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。
v 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。

　　2、 细胞学标记

　　　细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。

　　　　　　　　　 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。
可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。
染色体结构特征

带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄
和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染
色质的分布差异。

染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的
遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。

细胞学标记
　优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。
　缺点：
v （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力；
v （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料；
v （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应；
v （4）观察鉴定比较困难。

　3、 蛋白质标记

用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。

非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。

酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。

蛋白质标记的不足之处：
v （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；
v （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性；
v （3）标记的数量有限。

4 、 DNA标记

v DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。
v DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸系列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。

二、分子标记的类型及作用原理
三大类：
（1）基于DNA－DNA杂交的DNA标记
利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。
（2）基于PCR的DNA标记
根据所用引物的特点分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。
（3）基于单核苷酸多态性的DNA标记

何谓PCR？
v 聚合酶链反应
v (Polymerase Chain Reaction)简称PCR
v 是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

PCR原理

v 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

三个基本步骤:
v (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
解链;
v (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度
(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;
v (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适
温度下,以目的DNA为模板进行合成.
v 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达 倍。

PCR反应中的主要成份

v 1. 引物
v 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
v 3. Mg2+
v 4. 模板DNA
v 5. Taq DNA聚合酶
v 6. 反应缓冲液

遗传性疾病的基因诊断
　　在临床医学上，ＰＣＲ被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。
法医学
　　个人识别、亲子鉴定
　　1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA
指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。

　　　有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。
植物遗传育种
v 构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位
v 分子标记辅助育种
v 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化

畜 牧
v 畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测
v 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异DNA片段
v 构建基因图谱
v 检测基因整合与表达：转基因鱼

植物保护
病原微生物的基因型鉴定
植物病原微生物分类
形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分．

理想的DNA标记的应具备以下特点：
（1）表现稳定；
（2）数量多；
（3）多态性高；
（4）对目标性状表达无不良影响；
（5）部分标记的遗传方式为共显性，可鉴别纯合体和杂合体；
（6）信息量大，分析效率高；
（7）检测手段简单快捷，易于实现自动化；
（8）开发成本和使用成本低。

v 引物长度为9～10个碱基。

v 由于引物较短，在PCR中必须使用较低的退火温度，以保证引物能与模板DNA结合。

v RAPD标记的优点：对DNA需要量极少；对DNA的质量要求不高；操作简单易行；一套引物可用于不同生物的基因组分析。

AFLP标记
优点：可靠、高效。可在一个反应内检测大量限制性片段。
不足：需用同位素或非同位素标记引物，较费时耗材。

三个步骤
(1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在；
(2) 扩增反应；
(3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离．

（四）SSR标记　
（ Simple sequence Repeat ）
=(microsatellite)
=(Short Tandem Repeat,STR)
简单序列重复标记

v 优点：多态性丰富；操作简便，稳定可靠。
v 缺点：依赖测序设计引物，开发成本高。

第二节　
重要农艺性状基因
连锁标记的筛选技术

v 分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别的。
v 如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型。
v 因此，可以借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这称为分子标记辅助选择（MAS）。

用于MAS育种的分子标记需具备的条件：

１．分子标记与目标基因紧密连锁；

２．标记适用性强，重复性好；

３．不同遗传背景选择有效．

一、遗传图谱的构建
主要环节：
１、根据遗传材料的多态性确定亲本组合，建立作图群体；
２、群体中不同植株的标记基因型分析；
３、用计算机程序构建连锁群。

暂时性分离群体：F2、F3、F4、
BC、三交群体等。
两类分离群体

永久性分离群体：RIL、DH群体等。

二、近等基因系（NIL）的培育

v 近等基因系：一组遗传背景相同或相近，只是在个别染色体区段上存在差异的株系。

v 如果一对近等基因系在目标性状上表现差异，那么，凡是能在这对近等基因系间揭示多态性的分子标记，就可能位于目标基因的附近。

近等基因系是一系列回交过程的产物。

三、利用群体分离法进行性状标记

v 利用NIL寻找质量性状基因的分子标记的基本策略是比较轮回亲本、NIL及供体亲本三者的标记基因型。

v 当NIL与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的标记基因型不同时，则该标记基因就可能与目标基因连锁。

四、数量性状的基因定位
v 控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。

v 利用分子标记进行连锁遗传分析，可以检测出QTL，即QTL定位（QTL mapping)。

第三节　
作物MAS育种
一、作物MAS育种需具备的条件

１、分子标记与目标基因共分离或紧密连锁；
２、具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段（PCR)；
３、重复性好、经济、简单、易操作；
４、有相应的计算机数据处理软件。
二、MAS育种方法

１、回交育种
应用于单基因或寡基因控制的质量性状。

２、MAS聚合育种

　　　基因聚合就是将分散不同品种中的有用基因聚合到同一基因组中。

局限性:
（1）标记数量不够多，尤其是多基因控制的数量性状标记少；
（2）受遗传背景影响，一些QTL在不同作图群体中结果不一致；
（3）遗传图密度不够，标记与目标性状之间的遗传距离太大；
（4）分子标记辅助选择的技术要求高，成本高。