白肉灵芝水提物对新生大鼠胆红素脑病的影响.pdf

井冈山大学学报（自然科学版）66文章编号：1674-8085（2023）05-0064-09白肉灵芝水提物对新生大鼠胆红素脑病的影响*王昱1,2，何九军1,2（1.陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃，成县742500；2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃，成县742500）摘要：为了研究白肉灵芝水提物（ganoderma leucocontextum aqueous extracts,GLAE）对新生大鼠胆红素脑病的改善作用。腹腔注射胆红素建立高胆红素血症大鼠模型，将新生大鼠分成对照组、模型组、GLAE 低剂量组、GLAE 中剂量组和 GLAE 高剂量组，分别给予不同剂量的（0、50、100、200 mg/kg）GLAE 处理。利用试剂盒检测血液样本和大脑组织中总胆红素水平，比色法检测大脑组织 ATP 酶、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性和丙 二 醛（malondialdehyde,MDA）含 量，酶 联 免 疫 吸 附（ELISA）法 检 测 血 清 肿 瘤 坏 死 因 子-（tumornecrosisfactor-，TNF-）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、神经特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）和中枢神经特异性蛋白（central nerve specific protein,S100）的含量，实时荧光定量 PCR和 western blot 检测大脑组织 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease 3,Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2 相关 X（Bcl-2 assaciated X,Bax）、脑源性神经生长因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor,NGF）mRNA 水平和蛋白含量。结果显示，与模型组相比，经 GLAE 干预后，大鼠血清及大脑组织胆红素浓度明显降低（P 0.05，P 0.01）；大脑组织 SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和 Ca2+-ATP 酶活性显著升高（P 0.05，P 0.01），MDA 含量明显降低（P 0.05，P 0.01）；血清 TNF-、IL-1、NSE、S100含量显著降低（P 0.05，P 0.01）；大脑组织Caspase-3、Bax mRNA 水平和蛋白含量明显降低（P 0.05，P 0.01），Bcl-2、BDNF、NGF mRNA 水平和蛋白含量明显升高（P 0.05，P 0.01）。以上结果表明 GLAE 能减轻过量胆红素对新生大鼠的大脑损伤，其作用机制可能通过改善新生大鼠大脑能量代谢，提高大脑抗氧化能力，增加神经营养因子含量，抑制炎症反应及凋亡基因的表达来发挥作用。关键词：白肉灵芝水提物；胆红素脑病；抗氧化；神经营养；炎症；细胞凋亡；新生大鼠中图分类号：Q593+.1文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1674-8085.2023.05.010EFFECT OF GANODERMALEUCOCONTEXTUMAQUEOUS EXTRACTSON NEONATALRATS WITH BILLIRUBIN ENCEPHALOPATHY*WANG Yu1,2,HE Jiu-jun1,2（1.Technique College ofAgriculture and Forestry,Longnan Teachers College,Chengxian,Gansu 742500,China;2.Center for Research&Development of Longnan Characteristic Agro-bioresources,Longnan Teachers College,Chengxian,Gansu 742500,China）Abstract:To explore the improvement effect of Ganoderma leucocontextum aqueous extracts(GLAE)on neonatalrats with bilirubin encephalopathy.A hyperbilirubinemia model of nenonatal rats was established byintraperitoneal injection of bilirubin.After successful model establishment,the rats were divided into five groups:control group,model group,GLAE low-dose group,GLAE middle-dose group and GLAE high-dose group,andgiven GLAE at doses of 0,50,100,200 mg/kg by intragastric administration.The contents of bilirubin in serum收稿日期：2022-09-24；修改日期：2023-06-17基金项目：国家自然科学基金项目(32160055)；甘肃省科技重大专项(21ZD4NK045)；甘肃省陇南市科技计划项目(2019-ZD-10)作者简介：*王昱(1973-)，男，甘肃天水人，教授，硕士，主要从事天然产物药理、细胞与发育生物学研究(E-mail:).第 44 卷第 5 期Vol.44 No.5井冈山大学学报(自然科学版)2023 年 9 月Sept.2023Journal of Jinggangshan University(Natural Science)64井冈山大学学报（自然科学版）65and cerebral tissue of rats were detected by kit.Colorimetry was used to detect the activities of ATPase,superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT),glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)contents in cerebral tissue.And the contents of tumornecrosisfactor-(TNF-),interleukin-1(IL-1),neuronspecific enolase(NSE)and central nerve specific protein(S100)in serum were detected by ELISA.QuantitativePCR and western blot were used to detect mRNA and protein content changes of B-cell lymphoma-2(Bcl-2),cysteine aspartate protease 3(Caspase-3),Bcl-2 assaciated X(Bax),brain derived neurotrophic factor(BDNF)andnerve growth factor(NGF)in cerebral tissue.Results showed that compared with the model group,GLAEadministration could obviously decrease the bilirubin contents in serum and cerebral tissue to varying degrees,significantly activate the activities of SOD,CAT,GPx,Na+-K+-ATP and Ca2+-ATPase(P 0.05,P 0.01),whilereduce the contents of MDA in cerebral tissue(P 0.05,P 0.01).Moreover,the contents of TNF-,IL-1,NSEand S100 in serum increased(P 0.05,P 0.01).The mRNA levels and protein contents of Caspase-3 and Baxdecreased(P 0.05,P 0.01),meanwhile increased for Bcl-2,BDNF and NGF in cerebral tissue(P 0.05,P 0.01).The results of the present study indicated that GLAE could reduce the cerebral damage of excess bilirubinon new born rats.Its mechanism may be related to improving the cerebral energy metabolism,increasing thecerebral antioxidant capacity and neurotrophic factor content,inhibit expression of inflammatory response andapoptosis genes.Key words:Ganoderma leucocontextum aqueous extracts;bilirubin encephalopathy;antioxidant;neurotrophy;inflammation;apoptosis;neonatal rat高胆红素血症是新生儿中一种常发的疾病，主要临床表现为黄疸1。血清中高浓度的胆红素可透过血脑屏障，引发严重的并发症胆红素脑病，造成运动失调、肌张力障碍、智力低下、听力丧失、发育迟缓等后遗症，严重时可危及患者生命2-5。氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、能量代谢障碍等被认为是高胆红素血症致病的主要因素6-7。目前针对高胆红素血症临床上主要采用光疗和换血，药物治疗主要应用安妥明、茵栀黄等8。但这些治疗方法存在极大的风险性，诸如会引起排斥反应、恶心、肝毒性等不良反应。而传统中药或天然产物中含有大量的活性成分，因其以多靶点、多层次、副作用少的特点用来预防神经退行及相关疾病，已成为了现代生物研究的热点9。研究发现在神经功能障碍中，脑源性神经生长因子（brainderived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子（nerve growth factor,NGF)是两种重要的神经营养蛋白，对神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复具有重要作用10-11。神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）和中枢神经特异性蛋白（central nerve specific protein,S100）是神经细胞中特有的标记物，可作为检测脑损伤的重要 生 化 指 标12。B 淋 巴 细 胞 瘤-2（B-celllymphoma-2,Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease 3,Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2 相关 X（Bcl-2 assaciated X,Bax）是机体调控细胞凋亡的主要因子13。Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP 酶存在于组织细胞和细胞器膜上，它是稳定细胞形态结构和细胞功能重要的蛋白酶8。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）和 丙 二 醛（malondialdehyde,MDA）是反应组织细胞抗氧化能 力 的 主 要 检 测 指 标14。肿 瘤 坏 死 因 子-（tumornecrosisfactor-，TNF-）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）是促进发炎免疫系统中的物质15。以上基于脑组织能量代谢、抗氧化能力、神经营养因子、凋亡蛋白及炎症因子在神经元损伤中有重要地位，已被学者们认为是诊断神经功能退行性疾病的重要指标与有效治疗的靶点。白肉灵芝是我国灵芝属中的重要种类，含菌肉洁白，其多糖和三萜等活性成分含量较高，被井冈山大学学报（自然科学版）66视为高品质的灵芝种类16。现代药理研究表明，白肉灵芝中的生物活性成分稳定性高且易通过机体血脑屏障，能促进新生神经元的发生17-18，因此在防治神经退行性疾病中备受关注。本课题组前期研究表明，白肉灵芝水提物（ganodermaleucocontextum aqueous extracts,GLAE）在增加皮肤弹性、减少皮肤皱纹形成、保护脑缺血后大脑神经元及大脑皮层神经元炎症损伤等方面有重要作用15,19-20，但在改善胆红素脑病方面的研究未见报道。为了进一步探讨 GLAE 的生物学作用，本研究建立了高血脂症动物模型，运用比色法、酶联免疫吸附、western blot 和 real-time PCR 等研究了 GLAE 对胆红素脑病的改善作用及机制，以期为临床治疗相关疾病提供实验依据。1材料与方法1.1试剂及仪器GLAE 本实验室培养制备；晶体胆红素（货号：L20141213，美国 Sigma 公司），总胆红素试剂盒（货号：20150916，南京建成生物工程研究所）；ELISA 试剂盒大鼠 S100（货号：HL20001，上海哈灵生物科技有限公司）、大鼠 NSE（批号：20150903，上海江莱生物科技有限公司）、大鼠TNF-（货号：H052-1，南京建成生物工程研究所）、大鼠 IL-1（货号：H002，南京建成生物工程研究所）；SOD、CAT、GSH-Px、MDA、ATP酶（货号分别为：A001、A007、A005、A003、A016，自南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠BDNF、兔抗鼠 NGF 抗体（货号分别为 ab222060、ab52918，Abcam 公司），兔抗鼠 caspase-3（批号：HS0608，美国 Santa Cruz 公司），兔抗鼠 Bax、兔抗 鼠Bcl-2 抗 体（货 号 分 别 为：AB2915、AB10546，美国 millipore 公司）；-actin（批号4970L，Cell signaling 公司），HRP 标记山羊抗兔IgG（批号 GB23303，Servicebio 公司）；RNA 抽提试剂盒、反转录试剂、实时荧光定量 PCR 试剂购自 TakaRa 公司；引物由 Invitrogen(上海)公司设计合成。主要仪器设备：U-1800 型 UV-VIS 全自动分光光度计（日本 Tokyo 公司）；Bio-rad 550 型酶标仪（美国 Bio-rad 公司）；DYCPZ 型电泳槽、DYY-IB 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；GIS-500凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）；TGL-16M高速台式冷冻离心机（美国 Beckman-coulter 公司）；7900 HT Sequence Detection System 定量 PCR 仪（美国 ABI 公司）；核酸蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。1.2实验动物分组、造模和给药选取健康 7 日龄新生 SD 大鼠（购自兰州兽医研究所实验动物中心），SPF 级，许可证号：SCXK(甘)2015-0001，体质量为 12 15 g。实验参照文献21，10 只新生大鼠腹腔注射 0.5 mL 生理盐水作为对照组，其余大鼠腹腔注射 100 g/g 胆红素，每天注射次、共注射次，观察大鼠皮肤逐渐变黄并加重，出现反应迟钝、转圈、俯伏、肌张力发生障碍、吃奶困难等神经行为学症状，表明高胆红素血症大鼠模型建立成功。将建模成功大鼠随机分为 4 组，即模型组、GLAE 低剂量组、GLAE 中剂量组、GLAE 高剂量组，每组 10 只。GLAE 低、中、高剂量组分别灌胃（以体质量计）（50、100、200 mg/kg）的 GLAE19，对照组与模型组给予等体积生理盐水，连续处理 2 周。1.3胆红素含量测定末次给药 12 h 后处死大鼠，采血离心取血清，采用微板法试剂盒测定总胆红素含量；大脑额叶组织标本加入蛋白裂解液、制作匀浆液后采用微板法试剂盒测定总胆红素含量22。1.4抗氧化酶活性测定取大鼠大脑额叶组织，用预冷的生理盐水洗净血液，用滤纸吸干后称重、匀浆，3500 r/min 离心 10 min，按试剂盒的操作要求用全自动分光光度计测定 SOD、CAT、GSH-Px、ATP 酶活性及MDA 含量。1.5IL-1、TNF-、S100、NSE 含量测定井冈山大学学报（自然科学版）67血液 4 离心（3000 r/min）10 min，取血清参照 ELISA 试剂盒说明书的指导步骤检测其中IL-1、TNF-、S100、NSE 的含量。1.6PCR 检测大脑额叶组织 Caspase-3、Bax、Bcl-2、BDNF 和 NGF mRNA 的表达在 2.0 mL 的离心管中加入大脑额叶组织和Trizol 后用匀浆器反复研磨，离心（15 000 r/min）10 min，取上清液通过酚-氯仿抽提 RNA，再进行逆转录反应、PCR 扩增。PCR 按照试剂盒说明书进行操作。反应完毕采用 ABI 7500 软件分析，用2Ct方法进行相对定量。引物信息见表 1。表 1目的基因引物序列Table 1Primer sequence of target genes基因引物序列（53）gen bank 登录号产物长度(bp)Caspase-3F:GCACTGGAATGTCAGCTCGCANC_012064.1559R:GCCACCTTCCGGTTAACACGABaxF:AGGACGCATCCACCAAGAAGNC_048229.1166R:CAGTTGAAGTTGCCGTCTGCBcl-2F:AGCATGCGACCTCTGTTTGANC_000633.2108R:TCACTTGTGGCCCAGGTATGBDNFF:TAGGCAGAATGAGCAATGTCNC_005102.4178R:CCCAAGAGGTAAAGTGTAGAAGNGFF:TGGAGATAAGACCACAGCCANC_005101.4151R:TGACAAAGGTGTGAGTCGTG-actinF:CACCCGCGAGTACAACCTTCNC_000071.6207R:CCCATACCCACCATCACACC1.7Western blot 检测大脑额叶组织 Caspase-3、Bax、Bcl-2、BDNF 和 NGF 蛋白的表达在 RIPA 裂解液中加入大脑额叶组织制成10%的组织匀浆，4 离心（1200 r/min）15 min，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度。凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜和封闭。按抗体说明书加入兔抗鼠一抗 Caspase-3（1:2000）、Bax（1:1000）、Bcl-2（1:1500）、BDNF（1:1000）、NGF（1:1000），4 过夜，充分洗涤，加偶联辣根过氧化物酶（HRP）的二抗 IgG（1:2000），ECL 显色，以-actin（1:2 000）作为内参照，运用 Image J1.8.0 软件对 western blot 曝光结果进行灰度分析。1.8数据统计与分析用xs 表示数据，SPSS18.0 软件进行单因素方差分析，以 P 0.05 表示组间差异有统计学意义。2结果2.1GLAE 对高胆红素血症大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量的影响由图 1 我们可知，与对照组比较，模型组大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量极显著升高（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量显著降低，且呈剂量依赖性（P 0.05，P 0.01）。血清胆红素含量/mol/LCeCcCdBbAa大脑胆红素含量/mol/LtDeCdBcAbAa图 1GLAE 对高胆红素血症新生大鼠血清和大脑胆红素含量的影响Fig.1Effect of GLAE on bilirubin contents of serum andcerebrum in neonatal rats with hyperbilirubinemia注：组间条形图上标不同小写字母表示存在差异显著（P 0.05）；标不同大写字母表示差异极显著（P 0.05）2.2GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织抗氧化能力的影响由图 2 可知，与对照组结果相比较，模型组大鼠大脑额叶组织中 SOD、CAT 及 GSH-Px 活性极显著降低（P 0.01），MDA 含量极显著升高（P 0.01）；与模型组相比，经 GLAE 干预后，大鼠大脑额叶组织中 SOD、CAT 及 GSH-Px 明显升高（P 0.05，P 0.01），MDA 含量显著降低（P 0.05，P 0.01）。井冈山大学学报（自然科学版）68SOD 活性/U/mgCdBcAbAaAaCAT 活性/U/mgCeCdBcAbAaGSH-Px 活性/U/mgBdBcAbAaAaMDA 含量/nmol/mgAaBbCcCdCd图 2GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑抗氧化酶活性的影响Fig.2Effects of GLAE on cerebral antioxidant enzymeactivity in neonatal rats with hyperbilirubinemia2.3GLAE 对高胆红素血症大鼠血清 NSE、S100含量的影响由图 3 可知，与对照组相比，模型组大鼠血清 NSE、S100含量极显著升高（P 0.01）；与模型组相比，GLAE 低、中、高剂量组大鼠血清NSE、S100含量显著降低（P 0.05，P 0.01）。血清 NSE 含量/ng/mLCdBcCdBbAa血清 S100含量/pg/mLCeCdBcAbAa图 3GLAE 对高胆红素血症新生大鼠血清 NSE 和 S100含量的影响Fig.3Effects of GLAE on contents of serum NSE and S100in neonatal rats with hyperbilirubinemia2.4GLAE 对高胆红素血症大鼠血清 TNF-、IL-1含量的影响由图 4 可知，与对照组相比，模型组大鼠血清 TNF-、IL-1含量极显著升高（P 0.01）；与模型组相比，GLAE 低、中、高剂量组大鼠血清TNF-、IL-1含量显著降低（P 0.05，P 0.01）。TNF-含量/pg/mLDcCcDdBbAaIL-1含量/pg/mLCeCdCcBbAa图 4GLAE 对高胆红素血症新生大鼠血清 TNF-和 IL-1含量的影响Fig.4Effects of GLAE on contents of serum TNF-and IL-1 in neonatal rats with hyperbilirubinemia2.5GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织ATP 酶活性的影响由图 5 可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织 Na+-K+-ATP 和 Ca2+-ATP 活性极显著降低（P 0.01）；与模型组相比，GLAE 低、中、高剂量组大鼠大脑额叶组织 Na+-K+-ATP 和 Ca2+-ATP 活性显著升高（P 0.05，P 0.01）。井冈山大学学报（自然科学版）69Na+-K+-ATP 酶活性/mol/mgAaBcAbBdCeCa2+-ATP 酶活性/mol/mgAaAbBcCdCe图 5GLAE 对高胆红素血症新生大鼠血清 ATP 酶活性的影响Fig.5Effects of GLAE on serumATPase activity in neonatalrats with hyperbilirubinemia2.6GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织Caspase-3 蛋白及 mRNA 表达水平的影响由图 6 可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织 Caspase-3 蛋白及 mRNA 的表达量均极显著增加（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组大脑额叶组织 Caspase-3 蛋白及mRNA 表达量均显著降低（P 0.05，P 0.01），其中 GLAE 高剂量组的抑制效果更明显。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组-CaspaseCaspase-3 mRNA 表达量CdCcBbAaCeCaspase-3/-actin 蛋白表达量BdBcAbCeAa图 6GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑额叶组织Caspase-3 蛋白及 mRNA 表达的影响Fig.6Effect of GLAE on the expression of Caspase-3 proteinand mRNA in cerebrum of neonatal rats withhyperbilirubinemia2.7GLAE 对高胆红素血症大鼠肝组织 Bax 蛋白及 mRNA 表达水平的影响与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织 Bax蛋白和 mRNA 的表达量均极显著增加（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组大脑额叶组织 Bax 蛋白及 mRNA 表达量均显著降低（P 0.05，P 0.01），并呈现剂量相关性（如图 7）。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组-actinBaxBax mRNA 表达量CeAaBbCcCdBax/-actin 蛋白表达量BdBcAbAaDe图 7GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑 Bax 蛋白及mRNA 表达的作用Fig.7Effect of GLAE on the expression of Bax protein andmRNAin cerebrum of neonatal rats with hyperbilirubinemia2.8GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织Bcl-2 蛋白及 mRNA 表达水平的影响与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织中Bcl-2 蛋白和 mRNA 的表达量均极为显著地降低（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组肝组织 Bcl-2 蛋白及 mRNA 表达量均显著升高（P 0.05，P 0.01），其中 GLAE 高剂量组促进大鼠大脑额叶组织 Bcl-2 表达水平的效果优于GLAE 低、中剂量组（如图 8）。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组Bcl-2-actinBcl-2 mRNA 表达量AaCeCdBcBb井冈山大学学报（自然科学版）70Bcl-2/-actin 蛋白表达量AbBcDeCcAa图 8GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑 Bcl-2 蛋白及mRNA 表达的影响Fig.8Effect of GLAE on the expression of Bcl-2 protein andmRNAin cerebrum of neonatal rats with hyperbilirubinemia2.9GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织BDNF 蛋白及 mRNA 表达水平的影响由图 9 可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织 BDNF 蛋白及 mRNA 的表达量均极显著降低（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组大脑额叶组织 BDNF 蛋白及 mRNA 表达量均显著增加（P 0.05，P 0.01），提示 GLAE可显著促使高胆红素血症大鼠脑组织 BDNF 蛋白及 mRNA 表达水平上调。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组BDNF-actinBDNF mRNA 表达量AbAcAaCeBdBDNF/-actin 蛋白表达量AbBcCdDeAa图 9GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑 BDNF 蛋白及mRNA 表达的影响Fig.9Effect of GLAE on the expression of BDNF protein andmRNAin cerebrum of neonatal rats with hyperbilirubinemia2.10GLAE 对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织NGF 蛋白及 mRNA 表达水平的影响由图 10 可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织 NGF 蛋白及 mRNA 表达水平明极显著降低（P 0.01）；与模型组比较，GLAE 低、中、高剂量组大脑额叶组织 NGF 蛋白及 mRNA 表达水平均显著升高（P 0.05，P 0.01），且呈剂量相关性。提示 GLAE 可明显促进高胆红素血症大鼠大脑 NGF 蛋白及 mRNA 表达水平上调，使其表达水平显著升高。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组NGF-actinNGF mRNA 表达量AbBcCdAaDeNGF/-actin 蛋白表达量AbBcCdAaCe图 10GLAE 对高胆红素血症新生大鼠大脑 NGF 蛋白及mRNA 表达的影响Fig.10Effect of GLAE on the expression of NGF protein andmRNAin cerebrum of neonatal rats with hyperbilirubinemia3讨论新生儿的神经系统发育不完善，许多有害物质都能通过血脑屏障进入中枢神经系统而引发神经元损伤。黄疸是新生儿期常见的临床症状之一，其发病机制错综复杂。血中游离胆红素增高又是引发新生儿高胆红素血症脑病的重要致病因素1。过量的游离胆红素对中枢神经系统毒性是由可逆到不可逆逐渐发展的过程，可分为聚集、结合、沉淀三个步骤：首先单价胆红素阴离子聚集在神经元突触部位；其次与突触膜上的阳离子基团形成静电复合物，并掺和在细胞膜疏水脂质层中，这个过程可被外加白蛋白分子阻止并逆转；最后，井冈山大学学报（自然科学版）71当细胞膜脂质层中胆红素达到饱和状态时，诱导胆红素酸大量沉积于生物膜，影响神经细胞膜与线粒体的生物功能5。所以，前两个步骤对神经细胞损害是可逆的，而沉淀的损害是不可逆的。由于高胆红素血症脑损伤早期无特异性临床表现，导致治疗的滞后性，而早诊断并及时治疗常可恢复正常，这也是临床诊疗的重要依据。因此，本实验用高胆红素血症模型大鼠，从大脑能量代谢、抗氧化能力、神经营养因子、炎症反应及凋亡基因等方面，研究 GLAE 对大鼠高胆红素血症脑病的改善作用和作用机制。胆红素是一种免疫抑制毒性物质，当血中浓度增高时，胆红素可透过神经元、星形胶质细胞等，激活 NF-kB 信号通路，从而释放促炎细胞因子（TNF-、IL-1等）导致过度炎症反应，造成脑损伤23。NSE、S100是神经细胞内重要的功能因子，在中枢神经系统中高度特异表达，参与能量代谢、钙离子稳定等调控22。张小路等8研究表明新生儿高胆红素血症发生时可引起能量代谢障碍，降低脑组织中 Na+-K+-ATP 酶的活性，导致兴奋性氨基酸增多和细胞内 Ca2+超载，细胞凋亡增加，对胶质细胞和神经元都有毒性作用。同时，当高胆红素血致中枢神经系统损伤时，大量的 NSE、S100从损伤的神经细胞中释放进入血液和脑脊液5,8。因此，NSE、S100可作为高胆红素血症脑损伤程度及预后估计的判断标准。而脑损伤时，氧自由基会引发继发性损害作用，SOD、CAT、GSH-Px 和 MDA 都是反应组织氧化损伤生物标志物24。本实验采用腹腔注射胆红素溶液的方法构建高胆红素血症新生大鼠模型，结果显示，建模新生大鼠皮肤变黄，并逐渐加重，出现翻滚、俯伏、对外界刺激反应迟钝等症状，大鼠血清及大脑胆红素含量、血清 TNF-、IL-1、NSE、S100水平显著升高，大脑组织 SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和 Ca2+-ATP 酶活性显著降低，大脑 MDA 含量显著升高，表明胆红素引发了大脑神经细胞损坏、炎症反应、脂质氧化等病理变化，造成了神经功能障碍。不同剂量的 GLAE处理高胆红素血症模型新生大鼠后，其血清及大脑胆红素含量、血清 TNF-、IL-1、NSE、S100水平显著降低，同时大脑组织 SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和 Ca2+-ATP 酶活性显著升高，大脑 MDA 含量显著降低，表明 GLAE 可抑制大鼠的炎性因子和自由基释放，阻止炎症和氧化应激发生及进展，减轻脑损伤，改善神经功能障碍。Bcl-2 和 Bax 分别是抑制和促进细胞凋亡的关键调控基因，两者含量相对平稳地维系着细胞的新陈代谢。Caspase-3 被称为细胞凋亡的“分子开关”，是执行细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶13。一旦 Bcl-2 基因表达降低或 Bax 过量表达，均会活化 Caspase-3 基因刺激细胞加快凋亡和神经功能损伤加重8。因此，平衡 Bcl-2/Bax、抑制 Caspase-3可能是治疗胆红素脑病的重要靶点25。BDNF 和NGF 是最重要的神经营养因子，能促进细胞中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持细胞神经系统的正常功能，加快神经系统细胞损伤后的修复10-11。王娟等26研究高胆红素血症脑损伤时，发现 bFGF 对周围神经有营养、支持作用，同时海马区 bFGF 可通过调节 Bcl-2 和 Bax 的表达水平，参与高胆红素血症脑损伤后神经元的保护作用。因此，Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF 和NGF 因子与改善高胆红素导致的脑损伤有密切关系。本实验研究以实时荧光定量 PCR 和 westernblot 检测 GLAE 对高胆红素血症模型新生大鼠大脑组织 Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF 和 NGFmRNA 水平和蛋白含量的影响，结果显示，模型大鼠经不同剂量的 GLAE 处理后，其大脑组织Bcl-2、BDNF 和 NGF 表达升高，Bax、Caspase-3表达降低，且 GLAE 各组呈剂量依赖性，表明GLAE 可上调 Bcl-2、BDNF 和 NGF 表达，下调Bax、Caspase-3 表达，减轻神经元的损伤，从而改善了大鼠的神经功能。4小结综上所述，GLAE 可通过改善新生大鼠大脑能井冈山大学学报（自然科学版）72量代谢，提高其大脑抗氧化能力，增加神经营养因子含量，抑制炎症反应及凋亡基因来减轻过量胆红素对新生大鼠的大脑损伤。此研究为高胆红素血症脑病中药新药或保健食品研发提供参考和理论依据，也为探究中药多靶点协同调控脂质代谢作用提供了有益的研究思路。参考文献：1 张素冰,周秀英,宫昌磊.纳洛酮对高胆红素血症新生大鼠 Bcl-2/Bax 通路及神经功能障碍的影响J.中国优生与遗传杂志,2021,29(10):1378-1382.2 Agrawal A,Pandya S,Shrivastava J.Neurodevelopmentaloutcome at 6 months of age in full-term healthy newbornswith neonatal hyperbilirubinemiaJ.J.Clin.Neonatol.,2020,9(2):138-142.3 Lin YJ,Tsao PN.211 G to A variation of UGT1A1 andsevere neonatal hyperbilirubinemiaJ.Pediatr.Neonatol.,2018,59(1):106-107.4 欧小琴,龚春竹,郑忠梅,等.茵陈素调控 HIF-1/BNIP3通路对高胆红素血症新生大鼠模型