靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像.pdf

基金项目国家自然科学基金（81573280）通信作者（Corresponding author），Email：l_靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像徐辉军，王玉婷，秦亚娟，厉廷有*南京医科大学药学院，江苏南京211166摘要 目的：合成靶向髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的次氯酸（hypochloric acid，HClO）荧光探针并评估其HClO示踪活性。方法：以硅罗丹明为荧光团合成SiRhoGABAKYC，紫外分光光度计和荧光分光光度计检测其紫外光谱和荧光光谱以及pH稳定性和选择性，CCK8法检测细胞毒性，用共聚焦显微镜进行细胞荧光成像。结果：合成了SiRhoGABAKYC，对HClO响应高，选择性好，细胞毒性小，可示踪HeLa细胞中HClO浓度的变化。结论：探针SiRhoGABAKYC可用于检测HClO浓度进而反映MPO催化活性。关键词 髓过氧化物酶；次氯酸；荧光探针中图分类号 R446文献标志码 A文章编号 10074368（2023）10134208doi：10.7655/NYDXBNS20231002Hypochloric acid fluorescence probe targeting MPO for cell imagingXU Huijun，WANG Yuting，QIN Yajuan，LI Tingyou*School of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，ChinaAbstract Objective：The current study aims to synthesize hypochloric acid（HClO）fluorescent probes targeting myeloperoxidase（MPO）and evaluate its HClO tracing activity.Methods：Sirhodamine was used as the fluorophore to synthesize SiRhoGABAKYC.The UV spectrum，fluorescence spectrum，and pH stability and selectivity were detected with UV spectrophotometer and fluorescencespectrophotometer.Cytotoxicity was detected with CCK 8 method，and cell fluorescence imaging was performed by confocalmicroscopy.Results：SiRhoGABAKYC was synthesized，with a high response to HClO，a good selectivity，and a low cytotoxicity，which can trace changes in HClO concentration in HeLa cells.Conclusion：The probe SiRhoGABAKYC can be used to detect HClOconcentration，which in turn reflects MPO catalytic activity.Key words myeloperoxidase；hypochloric acid；fluorescent probeJ Nanjing Med Univ，2023，43（10）：13421349髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）介导吞噬体内卤代氧化剂的产生，在细菌杀伤，保护身体免受疾病侵害中起关键作用1。Chen等2研究发现MPO活性与脑卒中相关，在短暂性大脑中动脉闭塞（transience middle cerebral artery occlusion，tMCAO）和永久性大脑中动脉闭塞（permanent middlecerebral artery occlusion，pMCAO）动物模型中，缺血皮层中的MPO活性在缺血开始6 h升高，在第5天达到峰值，并在第15天逐渐恢复到基础水平。对缺血性卒中模型使用MPO抑制剂KYC可以减小脑梗死体积，保护血脑屏障，减轻神经缺损3-5。大量研究表明MPO可以作为脑卒中的标志物，且MPO抑制剂可以用于治疗脑卒中。次氯酸（hypochloric acid，HClO）常被认为是中性粒细胞介导的细胞内杀伤微生物的活性物质。当过氧化氢存在时，Fe3+MPO（天然酶）经历双电子氧化，形成化合物（+porFe IV=O）和H2O。化合物I可以通过卤化物（Cl-、Br-、I-，但不包括F-）或假卤化物（SCN-）的双电子还原转化为天然酶，在还原基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第10期2023年10月1342过程中产生各自的次卤酸（HClO、HBrO、HIO 或HOSCN），且由于血浆中Cl-的浓度远远高于其他卤化物，所以HClO是MPO卤化循环中最丰富和最重要的产物6。脑卒中发生后，MPO 被激活，引发HClO大量产生。近年来，HClO荧光探针的研究取得了显著进展，虽然已发表的探针在体外对HClO均有很好的灵敏度、选择性、稳定性，且在细胞实验中获得了优秀的检测效果，然而其较短的激发和发射波长（一般情况下ex 600 nm，em 650 nm）会带来多种问题，如可能会受到体内自身荧光信号的干扰、对生物样品产生光毒性以及可能出现光漂白现象等7-8。且它们没有靶向检测MPO的能力，在体内使用受到限制。本文以具有高光稳定性和近红外发射能力的硅罗丹明为荧光基团，通过酰肼硫脲键连接MPO的靶向基团 KYC 合成 SiRhoGABAKYC（图 1）9-10。HClO存在时硅罗丹明硫氨基脲会发生环化反应并产生显著的荧光启动反应11。该探针可在体外特异性检测HClO，可用于细胞成像。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂和仪器1H NMR、13C NMR（400 MHz核磁共振仪，JEOL公司，日本）；质谱（Agilent6410 LC/MS，Agilent 公司，美国）；硅胶板（薄层层析用，青岛化工研究所）；多功能酶标仪（SYNERGY H1，BioTek公司，美国）；气浴恒温振荡器（CHAS THZ82 ZD85，江苏正基仪器有限公司）；台式低速冷冻离心机（CenLee 5R，湖南湘立科学仪器有限公司）；CO2培养箱（HERAcell 150i，Thermo Scientific公司，美国）；紫外分光光度计（UV2450，Shimadzu公司，日本）；荧光分光光度计（FL4600，Hitachi公司，日本）；激光共聚焦显微镜（LSM 800，Zeiss公司，德国）。化学试剂除特殊说明外均为市售试剂。1.1.2细胞系与培养条件HeLa细胞常规培养于含10%胎牛血清，80 U/mL青霉素，0.08 mg/mL链霉素的DMEM培养基，置于5%CO2，37 的培养箱中。1.2方法1.2.1化合物的合成化合物的合成方法如图2所示。试剂和条件：正丁基锂，3溴N，N二甲基苯胺，四氢呋喃，-78 25；2羧基苯甲醛，溴化铜，140；水合肼，乙醇，80；二硫化碳，碘，三乙胺，四氢呋喃/水，0；N，N二甲基甲酰胺，氩气，90；固相肽合成。图2化合物的合成方法Figure 2Synthetic scheme for the compoundsSiNNNHNHNOSOHNNH2ONHHSONHOOHNH2图1探针SiRhoGABAKYC结构Figure 1The structure of SiRhoGABAKYCSiRhoGABAKYCNNSiONHHSOHNOOHNH2NNSiNOSNHNHONSHNONH2NHNHOOHSiRhoGABAOHNNNSiOOBrNSiNNNSiONNH2xhj21xhj22xhj23H2NOHONOHOSisoGABA第43卷第10期2023年10月徐辉军，王玉婷，秦亚娟，等.靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1342-13491343南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月1.2.1.1xhj21的合成于氩气保护下，将3溴N，N二甲基苯胺（10 g，50 mmol）溶于30 mL无水四氢呋喃（THF）中，冷却至-78，加入正丁基锂（nBuLi）（2.5 mol/L的己烷溶液，22 mL，55 mmol），反应 2 h 后，加入二氯二甲基硅烷（3.6 mL，30 mmol），升温至室温继续反应 2 h。反应结束后，加冰水淬灭，减压浓缩除尽THF后用乙酸乙酯（EA）萃取3次，合并有机层，加无水硫酸钠（Na2SO4）干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析 石油醚（PE）EA=50 1 得浅黄色油状液体 4.8 g，产率：64.34%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：7.25（d，J=5.6 Hz，1H），7.22（d，J=7.8 Hz，1H），6.93（d，J=2.7 Hz，2H），6.91（d，J=7.1 Hz，2H），6.76（dd，J=8.3，2.4 Hz，2H），2.92（s，12H），0.53（s，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：150.13，139.15，128.68，122.94，118.53，113.76，40.89，-1.95。高分辨质谱（HRMS）离子源类型（ESI）m/z：299.23 M+H+。1.2.1.2xhj22的合成将xhj21（1 g，3.35 mmol），2羧基苯甲醛（2.52 g，16.8 mmol）和溴化铜（CuBr2）（75 mg，0.34 mmol）置于耐压管中，升温至140 搅拌5 h。反应结束后，反应液冷却至室温，二氯甲烷（DCM）稀释后调节pH至碱性，用DCM萃取3次，收集有机相，无水Na2SO4干燥后减压浓缩，通过硅胶柱层析（PE EA Et3N=501 1）得粗品，再次通过硅胶柱层析（PE DCM=1 10），所得粗品用EA/PE（石油醚）重结晶得淡蓝色固体300 mg，产率：20.86%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：7.95（d，J=7.6 Hz，1H），7.62（td，J=7.5，1.0 Hz，1H），7.53（dd，J=11.1，3.9 Hz，1H），7.29（d，J=7.7 Hz，1H），6.96（d，J=2.7 Hz，2H），6.78（d，J=8.8 Hz，2H），6.54（dd，J=8.9，2.8 Hz，2H），2.95（s，12H），0.64（s，3H），0.60（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：170.90，154.57，149.44，137.17，133.85，128.86，128.34，127.21，125.82，124.76，116.79，113.48，92.06，40.48，0.63，-1.32。HRMS（ESI）m/z：429.22M+H+。1.2.1.3xhj23的合成将 xhj22（44 mg，0.10 mmol）溶于 5 mL 乙醇（EtOH）中，升温至80，加入85%水合肼（0.2 mL，3.48 mmol），搅拌回流 4 h，反应结束后减压浓缩。浓缩液用 EA 稀释，饱和食盐水洗涤 3 次，收集有机相，加无水Na2SO4干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析（PE EA=3 1）得8 mg 无色油状液体，产率：17.63%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：7.957.86（m，1H），7.347.26（m，2H），6.89（d，J=2.8 Hz，2H），6.886.85（m，1H），6.73（d，J=9.0 Hz，2H），6.63（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），3.68（s，2H），2.94（s，12H），0.60（s，3H），0.57（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：167.79，153.66，149.02，135.79，132.59，130.33，128.82，127.90，127.48，123.83，122.95，116.19，115.34，73.72，40.43，1.12，0.27。HRMS（ESI）m/z：443.26 M+H+。1.2.1.4isoGABA的合成将二硫化碳（1.74 mL，28.93 mmol）加入到氨基丁酸（GABA）（1 g，9.7 mmol）和 Et3N（3.4 mL，24.5 mmol）的THF/H2O（7 mL/7 mL）溶液中，于室温搅拌 14 h 后，冷却至 0，缓慢滴加碘（I2）（2.7 g，10.6 mmol）的THF（7 mL）溶液，滴加完毕后于0 继续反应3 h。反应结束后，向反应液加入6 mL 2 mol/L稀盐酸和 Na2SO3（0.24 g，1.9 mmol），加入 EA 分层，取有机层减压浓缩后通过硅胶柱层析（PEEA=21）得浅棕色油状液体 1.34 g，产率：95.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：9.32（s，1H），3.673.55（m，2H），2.50（dd，J=9.0，5.3 Hz，2H），2.061.90（m，2H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：178.69，131.06，44.35，30.83，25.04。1.2.1.5SiRhoGABAOH的合成将xhj23（550mg，1.24mmol）和isoGABA（4.32g，29.76 mmol）溶于干燥无水 N，N二甲基甲酰胺（DMF）（20 mL）中，在氩气保护下于90 搅拌过夜，通过TLC监测反应。反应完成后，冷却至室温，EA反复萃取3次，收集有机层。有机层用饱和食盐水冲洗3次后，无水Na2SO4干燥，减压浓缩后通过硅胶柱层析（PE EA=1 1）得淡绿色固体 440 mg，产率：60.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：7.97（d，J=7.1 Hz，1H），7.637.51（m，2H），7.12（d，J=7.5 Hz，1H），6.88（s，1H），6.83（d，J=2.8 Hz，2H），6.56（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），6.48（d，J=8.9 Hz，2H），5.72（t，J=5.8 Hz，1H），3.22（dd，J=13.0，6.7 Hz，2H），2.92（s，12H），2.081.99（m，2H），1.441.32（m，2H），0.53（d，J=4.3 Hz，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：182.91，177.83，168.00，153.26，149.24，137.95，134.40，129.88，129.35，129.20，128.72，124.72，123.93，115.92，114.76，73.75，43.92，40.22，31.07，23.83，0.36，-0.59。质谱MS（ESI）m/z：586.41 M-H-。1.2.1.6SiRhoGABAKYC的合成树 脂 溶 胀：称 取 Rink Amide 树 脂（0.97 g，0.71 mmol），加入DMF（9 mL）充分振摇使溶胀树脂，134430 min后抽干DMF。DMF洗涤6次，振摇5 min/次。肽键的形成：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF洗涤6次。加入FmocCys（Trt）OH（2.5 eq，1 038 mg），六氟磷酸苯并三唑1基氧基三吡咯烷基磷（PyBop）（2.5 eq，927 mg），1羟基苯并三唑（HOBT）（2.5 eq，240 mg），N，N二异丙基乙胺（DIPEA）（4.0 eq，472 L），DMF（9 mL），26 恒温振摇4 h。抽干，DMF洗涤6次，每次振摇5 min，抽干。二肽：加入含 20%哌啶的 DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振摇 40 min，抽干；DMF 洗涤 6 次。加入 FmocTyr（tBu）OH（2.5 eq，815 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 L），DMF（9 mL），恒温26 振摇4 h。抽干，DMF洗涤6次，振摇5 min/次，抽干。三肽：加入含 20%哌啶的 DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振摇 40 min，抽干；DMF 洗涤 6 次。加入 FmocLys（Boc）OH（2.5 eq，834 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 L），DMF（9 mL），恒温26 振摇4 h。抽干，DMF洗涤6次，振摇5 min/次，抽干。四肽：加入含 20%哌啶的 DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF洗涤6次。加入SiRhoGABAOH（1.05 eq，440 mg），PyBop（1.2 eq，460 mg），HOBT（1.2 eq，120 mg），DIPEA（2.0 eq，236 L），DMF（9 mL），恒温26 振摇4 h。抽干，DMF洗涤6次，振摇5 min/次，抽干。树脂后处理：DMF 洗涤 3 次，DCM 洗涤 3 次，MeOH 洗涤 3 次，DCM 洗涤 3 次，MeOH 洗涤洗涤3次，振摇5 min/次，洗涤后放入真空干燥器充分干燥。在上述充分干燥的树脂中加入三氟乙酸（9.5 mL）和三异丙基硅烷（0.5 mL），恒温26 振摇2 h，抽滤，滤液保存待用。此步骤重复2次，合并3次切割所得滤液，减压浓缩至小体积，加入冰乙醚析出沉淀，过滤干燥得粗品。溶解后用液相进行半制备。1HNMR（400 MHz，DMSOd6）：8.65（s，1H），8.00（dd，J=11.0，8.0 Hz，2H），7.90（d，J=6.9 Hz，1H），7.83（d，J=7.8 Hz，1H），7.767.56（m，5H），7.24（d，J=13.6Hz，2H），7.046.93（m，5H），6.726.27（m，6H），2.97（dd，J=16.0，5.4 Hz，3H），2.89（d，J=3.2 Hz，12H），2.832.67（m，5H），2.252.18（m，1H），1.87（t，J=7.2 Hz，2H），1.631.35（m，4H），1.21（d，J=6.9 Hz，4H），0.49（d，J=14.1 Hz，6H）。MS（ESI）m/z：491.341/2M+H+。1.2.2活性测试1.2.2.1光谱测量紫外测定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）与HClO（50 mol/L，PBS）于37 孵育30 min后检测紫外吸收光谱。荧光测定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）与HClO（50 mol/L，PBS）于37 孵育30 min后，检测激发光谱和发射光谱。pH 稳定性：在不同 pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5）的PBS缓冲液（50%DMF）中，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）与HClO（50 mol/L）于37 孵育30 min后，用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。浓度依赖性：在 PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）与HClO（0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、25.00、40.00、50.00 mol/L）于37 孵育30 min后检测荧光光谱。选择性：在 PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）与不同底物（50 mol/L）于37 孵育30 min后，用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。各组底物：Control；H2O2；HBrO；OH；tBuOO；ROO；TBHP；ONOO-；NO；10NO-2；11NO-3；12Na+；13K+；14Ca2+；15Mg2+；16Zn2+；17Cu2+；18Fe3+；19Cl-；20I-；21Arg；22Gly；23Glu；24Cys；25H2S；26GSH；27HOCl。1.2.2.2细胞毒性取处于对数生长期的HeLa细胞制成悬液并接种到 96 孔板中（细胞密度约为 5104个/孔），于37，5%CO2的孵育环境中培养12 h，加入SiRhoGABAKYC溶液（相当于细胞培养基中浓度为0、5、10、20、30、50 mol/L），另设空白组（无细胞），每组设6个复孔，于培养箱中继续孵育24 h，弃去上清液，加入100 L无血清培养基和10 L CCK8溶液，继续培养1 h后，在酶联免疫检测仪波长450 nm处测量各孔的吸光值。1.2.2.3外源性HClO细胞成像取处于对数生长期的HeLa细胞制成悬液，加入到预先放置盖玻片的24孔板中，于37，5%CO2培养箱中培养12 h，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗1次，加入不同浓度的次氯酸钠（相当于细胞培养基第43卷第10期2023年10月徐辉军，王玉婷，秦亚娟，等.靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1342-13491345南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月010203040508 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 0000荧光强度（a.u.）HClO浓度（mol/L）ABC640 660 680 700 720 740 760 780 8008 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 000050.0040.0025.0020.005.002.501.000.750.500.250荧光强度（a.u.）50 mol/L0HClOHClO（mol/L）波长（nm）A：在不同浓度HClO（050 mol/L）存在下，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）在PBS中的荧光光谱；B：在HClO 050 mol/L范围内对SiRhoGABAKYC的荧光强度进行线性拟合；C：在HClO 025 mol/L范围内对SiRhoGABAKYC的荧光强度进行线性拟合；PBS（50%DMF，pH 5.0），ex=620 nm，em=681 nm，n=3。图4SiRhoGABAKYC的浓度依赖性Figure 4Concentration dependence of SiRhoGABAKYC05101520258 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 0000荧光强度（a.u.）HClO浓度（mol/L）5506006507007508008 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 0000SiRhoGABAKYC+HCIO荧光强度（a.u.）激发光谱发射光谱波长（nm）3004005006007008000.030.020.010-0.01SiRhoGABAKYCSiRhoGABAKYC+HCIO吸光值波长（nm）ABA：在HClO（50 mol/L）存在下，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）在PBS中的紫外可见吸收光谱；B：在HClO（50 mol/L）存在下，SiRhoGABAKYC（5 mol/L）在PBS中的激发光谱和发射光谱，PBS（50%DMF，pH 5.0）。图3SiRhoGABAKYC的光谱特性Figure 3Spectral characteristics of SiRhoGABAKYC中浓度为0、5、10、15、20、30 mol/L）和optiMEM预孵育30 min后，更换optiMEM，然后加入SiRhoGABAKYC（细胞培养基中浓度为 10 mol/L，1%DMF）和Hoechst 33258（8 mol/L）孵育30 min后，弃去上清液，用PBS缓冲液清洗细胞3次，加4%多聚甲醛于室温下固定15 min后，用PBS清洗3次，取出盖玻片，细胞贴壁面朝下置于载玻片（滴加5 L抗荧光猝灭剂）上，盖玻片四周用指甲油密封，避光，使用Zeiss LSM 800激光共聚焦显微镜观察拍照。1.3统计学方法实验数据结果采用GraphPad Prism7软件分析，符合正态分布的定量数据以均数标准差（x s）表示。两组间比较采用t检验，P 30倍。8 0006 0004 0002 0000ROS/RNSBiomolecules荧光强度（a.u.）1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021222324252627底物存在各种分析物（50 mol/L）下探针SiRhoGABAKYC（5 mol/L）在 681 nm 处的荧光响应。1：Control；2：H2O2；3：HBrO；4：OH；5：tBuOO；6：ROO；7：TBHP；8：ONOO-；9：NO；10：NO-2；11：NO-3；12：Na+；13：K+；14：Ca2+；15：Mg2+；16：Zn2+；17：Cu2+；18：Fe3+；19：Cl-；20：I-；21：Arg；22：Gly；23：Glu；24：Cys；25：H2S；26：GSH；27：HClO，ex=620 nm，em=681 nm，n=3。图6SiRhoGABAKYC的选择性Figure 6Selectivity of SiRhoGABAKYC2.5探针的响应机制氧（硅）杂蒽螺环开环是检测次氯酸常用的一个识别基团，依照已有的研究猜测，它与HClO反应后，硅罗丹明氨基硫脲基团成环，氧（硅）杂环形成共轭结构，如图7所示。为了研究探针与次氯酸是否如预期反应，设计此实验。现设置如下3组实验：探针溶液，探针与HClO混合溶液，产物溶液，在37 孵育5 min后，使用液相进行分析，收集探针与目标产物的信号（图8）。探针与次氯酸的混合溶液中出现的新峰与产物峰保留时间一致，说明探针与次氯酸按照设第43卷第10期2023年10月徐辉军，王玉婷，秦亚娟，等.靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1342-13491347南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月想的机制进行反应。SiRhoGABAKYCONSiRhoGABAKYC+HClOSiRhoGABAKYCABC10111213141516时间（min）A：SiRhoGABAKYC；B：SiRhoGABAKYC+HClO；C：SiRhoGABAKYCON。图8HPLC分析结果Figure 8HPLC analysis2.6细胞毒性用 CCK8 比色法进行探针的细胞毒性实验。结果如图 9，HeLa 细胞与 50 mol/L 以下的 SiRhoGABAKYC孵育24 h后，细胞存活率超过90%，表明SiRhoGABAKYC对HeLa细胞的毒性很小，生物相容性好，细胞对10 mol/L的探针是完全可以耐受的。0510203050SiRhoGABAKYC浓度（mol/L）100500细胞活力（%）图9SiRhoGABAKYC对HeLa细胞活力的影响Figure 9Effect of SiRhoGABAKYC on relative of cellviability of HeLa cells2.7外源性次氯酸成像为了考察探针对细胞中外源性HClO的成像能力，用不同浓度的 HClO 处理 HeLa 细胞（图 10）。荧光强度随外源性 HClO 浓度升高而增强，加入30 mol/L HClO 孵育的荧光强度比对照组增强2 倍，表明探针能够有效检测HeLa细胞的外源性HClO，且与HClO呈浓度依赖性增强。MergeHoechstSiRhoGABAKYC0510152030051015203043210相对荧光强度*HClO浓度（mol/L）HeLa细胞与HClO（030 mol/L）孵育30 min，再与SiRhoGABAKYC（10 mol/L）孵育30 min的荧光成像和荧光强度。与0 mol/L组比较，*P 0.05，*P 0.001，n=3。图10SiRhoGABAKYC对细胞中外源性HClO的成像能力Figure 10Imaging ability of SiRhoGABAKYC for exogenous HClO in cells3讨论HClO是氧化应激中非常重要的一类生物标志物，它的过量产生与多种疾病密切相关。脑卒中发生后，MPO 表达量和催化活性上调，HClO 生成增加。目前，HClO荧光探针的研究取得了显著进展，虽然这些HClO探针在体外对HClO均有很好的灵敏度、选择性、稳定性，但没有靶向检测MPO的能力。在此前提下，设计合成了SiRhoGABAKYC。该探针对HClO响应较高，选择性好。细胞实验结HClO浓度（mol/L）1348果表明探针对细胞毒性小，对细胞外源性的HClO有较好的检测能力。希望可以对该探针进行深入的研究，用于生物活体成像，以期最终应用于脑卒中的诊断和治疗。参考文献1 ARNHOLD J.The dual role of myeloperoxidase in immuneresponse J.Int J Mol Sci，2020，21（21）：80572 CHEN S，CHEN H，DU Q，et al.Targeting myeloperoxidase（MPO）mediated oxidative stress and inflammationfor reducing brain ischemia injury：potential applicationof natural compounds J.Front Physiol，2020，11：4333 YU G，LIANG Y，HUANG Z，et al.Inhibition of myeloperoxidase oxidant production by Nacetyl lysyltyrosylcysteine amide reduces brain damage in a murine model ofstroke J.J Neuroinflammation，2016，13（1）：1194 KIM H J，WEI Y，WOJTKIEWICZ G R，et al.Reducingmyeloperoxidase activity decreases inflammation andincreases cellular protection in ischemic strokeJ.JCereb Blood Flow Metab，2019，39（9）：1864-18775 WANG Y C，LU Y B，HUANG X L，et al.Myeloperoxidase：a new target for the treatment of stroke?J.NeuralRegen Res，2022，17（8）：1711-17166 DENG B，REN M，KONG X，et al.Development of anenhanced turnon fluorescent HOCl probe with a largestokes shift and its use for imaging HOCl in cells andzebrafishJ.Sens Actuators B Chem，2018，255：963-9697 YUAN L，LIN W Y，ZHENG K B，et al.Farred to nearinfrared analyteresponsive fluorescent probes based onorganic fluorophore platforms for fluorescence imagingJ.Chem Soc Rev，2013，42（2）：622-6618 SUN Y 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