HEK293 CELL.doc

Cell Name
HEK293
Animal
Human
Scientific Name
Homo sapiens
Tissue
Kidney
Medium
DMEM with 10% FBS and 5ml Antibiotic
Passage Method
Treated with 1X Trypsin-EDTA
Cell no. at passage
from 1/3 to 1/12
Life span
Infinite
Morphology
Epithelial-Like
Characteristics
Transformed embryonal kidney by adenovirus
Classification
Transforms
Established by
Graham,F.L.
 HEK293 Freezing Process

【摘要】  目的 通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究，为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法 复苏培养人胚肾293细胞，倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，冻存保留细胞。结果 人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好，6h后大部分细胞已经贴壁，8h细胞已完全贴壁。结论 人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的，为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。
【关键词】  人胚肾293细胞 细胞培养 冻存

    Anabiosis and Cultivation of HEK-293 Cells and CryopreservationYANG  Biao1, MEI Xi-fan1, LIU Fu-qiang2
    (1.Department of Orthopaedics ，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University；
    2.Department of Endocrine，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000 China)【Abstract】  Objective  To lay foundation for establishing substructure of stem cells’ labeling and transplantation therapy experimentation through the research on anabiosis and cultivation of HEK-293 cells and cryopreservation.  Methods  By resuscitating and cultivating HEK-293 cells, observe them with inverted microscope，calculate adherence rate，draw growth curve， cryopreservate and reserve it.   Results  HEK-293 cells grow well in the common cultivating conditions. Most of the cells have adherenced after 6 hours, and all cells have adherenced after 8 hours.  Conclusions  It is convenient and feasible to adopted improved ways to resuscitate and cultivate HEK-293 cells. In this way, we have established substantial substructure of stem cells’ labeling.
    【Key words】  HEK-293 cells；cell culture；cryopreservation
    干细胞是近年医学研究的热点之一，并显示了良好的应用前景。干细胞移植的实验研究，离不开对移植细胞示踪标记作用。绿色荧光蛋白标记具有检测方便、表达稳定和不影响细胞功能等优点，从而被广泛地用于示踪标记移植干细胞在体内的分布、含量、分化等方面的研究［1］。而在为数众多的载体中，腺病毒载体具有宿主范围广、繁殖快、腺病毒复制缺陷型相对安全等诸多优点而被广泛应用［2］。人胚肾293细胞(HEK－293细胞)是最常用于包装及扩增腺病毒载体的工具细胞，因此探索一条快速、适用、方便、简洁、有效的细胞标记体系是做干细胞移植实验的必经之路。本实验从细胞标记的一个侧面通过对工具细胞HEK－293细胞的复苏培养扩增及其冻存作用的研究，旨在为进一步行干细胞标记及移植治疗实验奠定基础。
    1  材料和方法
    1.1  主要试剂与仪器
    HEK-293细胞 (军事医学科学院基础医学研究所保存)，DMEM培养基（购自GIBCO公司），胰蛋白酶、胎牛血清(购自Sigma公司)，二甲基亚砜DMSO（购自GIBCO公司）;主要仪器：倒置相差显微镜（日本 OLYMPUS IMT-413），CO2孵箱（日本YAMATO IT-61）。
    1.2  HEK-293细胞的复苏培养传代及冻存
    1.2.1  细胞的复苏培养  从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/mL密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养。
    1.2.2  细胞传代  原代培养的HEK－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。
    杨彪，等.HEK－293细胞复苏培养及冻存辽宁医学院学报  2007年12月，28(6)1.2.3  细胞冻存  代传培养细胞融合度至60％～70％(处于对数生长期)进行冻存，在冻存细胞前1d换液，贴壁细胞用常规方法将细胞消化下来，制备成单细胞悬液;收集单细胞悬液，然后1000r/min离心5min;弃上清，用冻存液(培养基、小牛血清及二甲基亚砜以6∶3∶1比例配成)混悬沉淀细胞，调整细胞浓度至1×106/mL～10×106/mL;将细胞悬液按冻存管大小分装(0.5～1.5mL/管)，拧紧管口，标明细胞名称和冻存时间；在4℃下放置30min，然后移入－80℃超低温冰箱中过夜，后转移至液氮罐中保存。
    1.3  细胞形态的观察  在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
    1.4  细胞的计数  常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用PBS重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/mL原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。
    1.5  细胞的贴壁率  指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。
    1.6  生长曲线  取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1mL培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。
    2  结    果
    2.1  HEK-293细胞复苏及培养
    复苏后的HEK-293细胞在标准培养条件下，5h左右可贴壁生长，倒置显微镜观察呈三角形或多角形，胞浆透亮，胞核隐约可见，有的胞膜向周围突起成不规则形(图1)。
    图1  复苏后培养4d的HEK－293细胞（×100）
    2.2  细胞的贴壁率  传代后2、4、6、8h各时间点细胞的贴壁率分别为28％、62％、90％和100％，见6h后大部分细胞已经贴壁，8h细胞已完全贴壁（图2）。
    图2  复苏后8h内HEK－293细胞的贴壁率
    2.3  细胞的生长曲线  由生长曲线可以看出，细胞传代后1～2d细胞数目有所减少，为潜伏适应期；3～5d细胞增值活跃进入指数生长期，6d细胞融合度可达到85％以上，细胞增值减缓进入平台期（图3）。
    3  讨    论
    大量的实验研究和临床观察表明干细胞移植在多种疾病的治疗和创伤修复中可起到良好的效果。本课题组围绕干细胞移植修复脊髓损伤这一课题展开多方面的实验研究，但移植干细胞植入脊髓损伤动物模型体内后能否存活，存活率能达到多少，能否促进损伤脊髓的修复以及植入体内后的分布和转归等情况尚不清楚。这些问题首先依赖于对干细胞的有效标记和示踪。绿色荧光蛋白是从水母中分离出来的一种具有自发荧光的小分子蛋白质［3］，在蓝光或近紫外光的照射下，不需加入任何反应底物或酶即可发射绿色荧光，且荧光性质十分稳定，无光漂白现象发生。与以往常用的报告基因相比，GFP具有诸多的优点在生物医学领域的应用日益广泛［4］。而目前，常用的增强型绿色荧光蛋白标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。采用病毒载体转染仍然是一种较为有效和常用的方法。
    HEK-293细胞是目前最为常用的用于包装及扩增腺病毒表达载体的工具细胞，具有使用方便、永生化、培养条件低、增殖周期短等诸多优点，但该细胞在培养过程中不容易贴壁，生长活力低，易造成损伤，而且随着传代次数的增加包装病毒的生物学特性会丢失，在我们复苏培养的过程中也发现了一些诸如对酶敏感度高、离心吹打等机械刺激对细胞损伤大、高代次细胞活性差等问题影响实验结果，因此在对HEK-293细胞的复苏培养扩增及冻存的过程中一般注意以下几点:(1)尽量利用低代次的HEK－293细胞，以保证细胞有良好的活力；（2）细胞复苏要在1min内使冻存细胞完全融化，复温速度太慢会造成细胞损伤；（3）在复苏及传代的过程中尽量不用或少用离心沉积细胞，以减少离心剪切力对细胞的破坏作用；（4）HEK－293细胞本身贴壁并不十分的牢靠，因此在传代过程中胰酶消化的时间不宜过长，以免造成消化过度影响细胞的活力，吹打细胞要缓慢，避免用力直接吹打细胞，造成不应有的细胞损伤；（5）冻存细胞应具有较高的活力，选取处于对数生长期的细胞进行冻存，保存的细胞相对活性好；（6）常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此应将冻存液在4℃条件下放置40～60min后使用。另外HEK－293细胞在培养的过程中传代时的融合度及传代比率也会影响到细胞的生物学性状［5］，因此我们在进行细胞传代时的融合度一般控制在60％～70％，传代比率不超过1∶4，实践证明效果较好。
    总之，HEK－293细胞是近年来刚刚兴起的用于细胞标记及载体构建理想的工具细胞，尽管HEK－293细胞不同于其他细胞，有自身特有的生物学特性，但经过长期的试验研究，我们总结出的这一整套针对HEK－293细胞保存复苏培养及扩增的细胞培养技术，其操作简便又切实可行，为进一步行载体构建及细胞标记打下了坚实的基础。
【参考文献】
  ［1］ 关云谦，陈彪．刘平，等．干细胞脑内移植有效标记研究：绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值［J］．中国临床康复，2004，8(13)：2506-2508.

［2］ 陈枫，赵新华，刘安敏. HBsAg腺病毒疫苗载体的构建及293细胞中的包装表达［J］．中国免疫学杂志，2006， 22(12):1137-1139.

［3］ Shimomura O. The discovery of aequorin and green fluorescent protein［J］. J Microsc,2005,217(1):1-15.

［4］ Shaner NC, Steinbach PA,Tsien RY. A guide to choosing fluorescent proteins［J］.Nat Methods，2005,2(12):905-916.

［5］ Ng P, Parks RJ, Cummings DT, et al. A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors ［J］.Hum Gene Ther,1999,10(16):2667-2672.