SD大鼠骨髓间充质干细胞培养流程.doc

SD大鼠骨髓间充质干细胞培养流程
姓名：李静 专业：血液内科 学号：201210062 导师：赖永榕
研究背景
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚层，是优质的种子细胞，亦是骨髓中存在的除造血干细胞外的另一类干细胞。由于取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。但是骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少，在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。
研究目的
本实验通过BMSCs的黏附特性，应用全骨髓贴壁培养法，建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化BMSCs的方法，观察大鼠BMSCs的生物学特性，为后续利用BMSCs治疗血液疾病的研究提供稳定的干细胞模型。
一、实验材料与方法
（一）材料与试剂
生后30d的雄性SD大鼠，体质量100g，SPF级；DMEM培养基；青霉素、链霉素；胎牛血清；淋巴细胞分离液；0.25%胰蛋白酶；兔抗鼠CD34、CD44、CD45、CD105、CD90荧光抗体；CO2培养箱；倒置相差显微镜；SW-CJ 型生物洁净工作台。
（二）方法
BMSCs的原代分离培养：2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的L-DMEM培养基冲出骨髓，反复吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液。将冲洗下来的液体制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15%胎牛血清的DMEN-LG培养基重悬离心管中的骨髓间充质干细胞，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将骨髓间充质干细胞不断纯化。当细胞生长融合达80%-90%时，用1:1的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸溶液消化分散细胞，在显微镜下控制消化时间，计数细胞，以1:3密度扩增培养。此时标记为P1代。
BMSCs的培养、纯化及传代：原代培养过程中，48h后全量更换培养基，以后每3d全量更换新鲜培养基。待细胞铺满培养瓶底至细胞融合成单层，密度长至70%~80%融合时，用0.25%胰酶消化，1：2的比例进行传代培养。
BMSCs的形态学观察及Giemsa染色：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 /L，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75mL，以后每3d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10min，Giemsa染液染2min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
BMSCs生长曲线测定：将生长状态良好的SD大鼠骨髓间充质细胞传至2代并接种于96孔培养板，接种密度5×103/孔，将培养板移入CO2培养箱中培养。每日取一板进行MTT检测。选择492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
BMSCs的细胞周期检测：取第3代细胞，调整细胞浓度为1.0×109 /L。加100μL RNase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期。
BMSCs鉴定：流式细胞仪检测细胞表面标记：收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4℃离心，1000r/min，5 min，用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90、CD105。同时每管样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45 min，用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500μL PBS(含1%BSA) 重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
二、讨论
MSCS这个概念是由Friedenstein和他的同事在40多年前提出的。随后的研究发现其具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓间质等多种间充质组织分化的潜能,近来又有研究发现BMSCs与肿瘤的发生、发展有着重要的联系。因此,如何培养出高纯度、稳定的BMSCs,是进行更深一步研究的基础。
骨髓中间充质干细胞的含量较低,约为0.001%～0.01%。目前用于分离BMSCs的方法主要有四种:贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。贴壁细胞分离法是最早的方法,是根据MSC具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;但所得细胞的成分复杂,骨髓间充质干细胞的纯度不足。密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用Percoll将其分离出来;使用Percoll分离液密度梯度离心的方法,能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来,同时操作简便快速,对细胞的活性影响较小。流式细胞仪分离的方法则是根据BMSCs的细胞体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选。应用单克隆抗体免疫磁珠分离系统或流式细胞仪技术,对细胞的活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性。如果采用梯度密度离心法、免疫磁珠法和流式细胞仪法分离单个核细胞,首先需要一定量的骨髓组织,其次也需要有特殊的仪器设备。1只1月龄SD大鼠两只股骨和胫骨骨髓组织含量较少。经过穿刺吸取或本实验所采用的剪去骨端用培养液冲洗所能得到的骨髓组织就更少。大鼠骨髓组织量少不足以采用以上几种方式分离间充质干细胞。对初次培养者来说,贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简单易掌握,不易发生污染,是一个较好的分离方法。贴壁分离法根据骨髓中间充质干细胞贴壁生长,而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性将其分离开来。用贴壁分离法分离出的骨髓间充质干细胞均一性不及其他方法,但其分化诱导特性不受影响。
体外培养的BMSCs体积小，成梭形或多角形，核浆比大，多为平行排列生长或漩涡状生长，部分贴壁细胞可以快速形成集落，一些呈典型的纺锤形样的BMSCs增殖迅速，形态均一。细胞传代后，传代细胞较原代细胞的贴壁速度快，细胞传到第3代时细胞形态比较一致。在光镜和相差显微镜下，BMSCs为长梭形，类似成纤维细胞外观。透射电镜下BMSCs可表现为两种不同的形态结构类型:一种是处于相对静息状态的细胞，核较大，核质比大，胞质内细胞器少;另一种是处于相对活跃期细胞，细胞体积大于前者，核不规则，含2～3个核仁，核质比小，胞质中有丰富的细胞器。
目前国内外学者尚未发现骨髓间充质干细胞具有特征性的表面标志，其可表达间质细胞、内皮细胞、表皮细胞等多种细胞的表面标志，但一般认为CD90、CD71、CD44、CD29、CD105、CD106等是BMSCs的重要表面标志物。同时BMSCs又缺乏特异的表面标记，因而使人们在鉴定体外分离和培养的BMSCs时出现困难。最新的研究发现随着培养代数的增加,BMSCs与纤维母细胞表面抗原的差异会减小,并且用于检测的一些抗体如CD105、CD166、CD90、CD44、CD29、CD73等也表达于肺或者皮肤的纤维母细胞 。
目前BMSCs的鉴定主要根据其形态和培养特性:一般认为BMSCs经体外培养其细胞体积小，呈梭形，核浆比例较大，能传代培养。但是最可靠的检测方法是其多能的分化特性。