SC∕T 7232-2020 虾肝肠胞虫病诊断规程(水产).pdf

ICS 65.020.30 B 41 :斗时中华人民共和国水产行业标准SC/T 7232一2020虾肝肠胞虫病诊断规程Code of d.iagnosis for Enterocytozoon hepatopenaei d.isease 2020-08-26发布2021- 01 - 01实施J:气中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7232-2020 本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本标准起草单位.天津市水生动物疫病预防控制中心、中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人:耿绪云、刘群、王辛辛、韩进同IJ、赵良炜、徐赞霞、梁艳。I SC/T 7232-2020 虾肝肠胞虫病诊断规程范围本标准给出了虾肝肠胞虫病(Enterocytozoonhepato户enaeidisease)诊断试剂和材料、器材和l设备、临床症状，规定了采样、组织病理、套式PCR和TaqMan荧光定盘PCR等病原检验的3种方法和综合判定。本标准适用于虾-PR叩U牛队BHCVSr EEFFSTT 2 下列什、凡是不注日期的引GB/T 28630 SN/ T 1193 3 缩赂语4 4.1 当纯度的水。12中第3章的规定4.2 执行。4. 3元水乙蹲分析纯。4.4 10XPCR缓冲液:随Taq4. 5 MgCl2 (25 mmol/U，一20C保存。4.6 dNTPs(各2.5mmol/U 含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L的混合物，-20C保存，用于PCR.4. 7 日qDNA聚合酶(5U/U， -20C保存。4.8 2X预混液(2XPremixEx Taq)。4 9 套式PCR寻|物的目的基因为SWP基因，对虾肝肠胞虫有很高的特异性，浓度为10mol/L.序列如下:514F,5-TTG-CAG-AGT-GTT-GTT-AAG-GGT-TT-3 ; 514R, 5 -CAC-GAT-GTG-TCT-TTG-CAA-TTT-TC-3 , ; 147F, 5-TTG-GCG-GCA-CAA-TTC-TCA-AAC-A-3; SC/T 7232-2020 147R, 5 -GCT-GTT-TGT-CTC-CAA-CTG-T A T-TTG-A-3 4.10 TaqMan荧光定量PCR引物和探针的目的基因为SSUrRNA基因，对肠胞虫属有较好的特异性，但对虾肝肠胞虫的特异性不高，浓度为10mol/L。序列如下157F, 5 -AGT-AAA-CTA-TGC-CGA-CAA-3 ; 157R, 5 -AAT-TAA-GCA-GCA-CAA-TCC-3 ; TaqMan探针，5-FAM-TCC-TGG-TAG-TGT-CCTTCC-GT-TAMRA-30 4. 11 矿物泊要求无DNA酶和RNA酶，用于元热盖的PCR扩增仪，还可以降低气溶胶产生的风险。4.12 分子量标准，DL2 000 Marker 0 4.13 琼脂糖。4.14 抽提液1，按附录A中A.2的规定执行。4 15 扣l提液JI，按A.3的规定执行。4.16 TE缓冲液，按A.4的规定执行。4 17 1X TAE电泳缓冲液:按A.8的规定执行。4.18 核酸凝胶染色剂10mg/mL澳化乙键(EB)储存液按A.10的规定，或其他EB替代品。4.19 组织病理阳性对照受EHP感染的对虾制成的组织切片。4.20 组织病理阴性对照:未受EHP感染的对虾制成的组织切片。4.21 套式PCR和TaqMan荧光定盘PCR阳性对照:为已知EHP阳性的组织样品DNA模板，满足PCR分析需要.-200C保存。4.22套式PCR和TaqMan荧光定量PCR阴性对照:为已知EHP阴性的组织样品DNA模板.-200C 保存。4.23 套式PCR和TaqMan荧光定量PCR空白对照为无菌双蒸水。5 器材和设备5. 1 组织病理法所用器材和设备:按照GB/T28630. 4-2012中第4章的规定执行。5.2 PCR扩增仪。5. 3 实时荧光定量PCR仪。5. 4 核酸浓度测定仪。5 5 电泳仪。5.6 水平电泳糟。5. 7 紫外观察仪或凝胶成像仪。5 8 普通台式高速离心机。5 9 手掌型离心机。5. 10 7J浴锅或金属浴。5 11 普通冰箱。5. 12 加热设备-电炉或微波炉等。5 13 微量移液器盘程O.1L-2.5L、O.5L-10L、2L-20L、20L-200L、100L-1000Lo 5. 14 分析天平.可精确称量到0.0001g的天平。6 I临床症状患病对虾肝膜腺和肠道颜色较深，严重者肝膜腺萎缩，生长缓慢，个体明显偏小，感染群体生长差异明显增大。在正常养殖条件下，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大量、急性死亡。体长相同时，发病群体的平均体重约为EHP阴性群体的70%(参见附录B)。7 采样7.1 采样对象SC/T 7232-2020 凡纳滨对虾(Li归户enaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、日本缝对虾(Marsu户enaeusJ011lC)等对虾，参见附录B。轮虫、卤虫等容易携带EHP的饵料生物。72 采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630. 4-2012中附录B的要求。7.3 样品的采集7. 3. 1 对虾受精卵、幼体、仔虾取完整个体;幼虾至成虾阶段取去除O柄的头胸部(肝膜腺、鲤、丝、心脏等)、肠组织或粪便。7.3.2 受精卵、幼体、仔虾或达到0.5g样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检验。轮虫、卤虫取完整个体，可以合并样本进行检验。进行荧光定盘PCR检验时，需要对样本进行称重;采集的粪便干燥后称重。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或于一200C暂时保存。8 病原检验8 1 组织病理8. 1 1 检验方法按照GB/T28630. 4-2012中第5章的规定执行。选取肝膜腺和肠道进行组织病理检验。8.12 结果判定8.12 1 正常样品的ff膜腺或肠道组织切片经H-E染色后，核质反差明显，肝腋腺小管和肠道上皮细胞质染成紫红色，细胞核大而呈椭圆形或圆形，染色质和核仁明显，染成蓝紫色。8.122 虾肝肠胞虫主要寄生在虾的肝膜腺和肠道组织中。8 12.3 被感染的对虾肝膜腺小管上皮细胞胞质内有抱袭，高倍油镜下少量细胞可见嗜碱性胞质包涵体，并可见密集的大小在lm左右的粒状抱子。8.2 DNA提取8.2 1 样品DNA的提取应在样品区独立完成，避免造成区域间污染。8.22 称取100mg组织样品，放入1.5 mL的离心管中，再加入900LCTAB(见附录A中的A.1，用前加疏基乙晖至终浓度0.25%)并混匀。250C作用2人8 2 3 上述混合溶液加入拍提液1(见A.2)500L，用力振摇3050 12000 r/min离心5min，分离两相。吸取上层水相800L宜于灭菌1.5 mL离心管中。824 再加入拍提液!I(见A.3)700L，用力振摇305012000 r/min离心5min，分离两相。吸取上层水相600L置于灭菌1.5 mL离心管中。8.25 再加入无水乙碎(-200C预冷)900L(1. 5倍体积)，颠倒混匀。-200C过夜沉淀。12000r/min 离心30mino弃上清液，待干燥后加TE缓冲液(见A.4) 100L溶解作为PCR模板。8 2 6 除CTAB提取方法外，可使用达到同等效果的其他方法或商业化提取试剂盒。8.27 采用荧光定盘PCR法进行检验时，窃以样品的DNA模板盘或组织盆作为基数进行样品的拷贝数对比。前者需要对提取的DNA进行浓度及纯度测定，后者应考虑样品提取中的回收率，按上述方法进行提取时，模板DNA样品中的相对组织盘可按如下方法计算，100mg/l 000LX800L/800L X600 L/I00L=0.6 mg/L。8. 3 套式PCR8. 3. 1 扩增区域样品的PCR扩增应在PCR反应区独立完成，避免造成区域间污染。3 SC/T 7232-2020 8.3.2 套式PCR第一步8.3. 2. 1 PCR反应体系(25L)包括，514F寻|物(10mol/L)和514R引物(10mol/L)各O.5L，0.5 L dNTPs (各2.5 mmol/L) ,1. 5L MgCl, (25 mmol/L) ，2.5L 10X PCR Buffer,O . 5 U Taq DNA聚合酶，模板基因组DNA1L，最后用水定容至25LoPCR反应体系中的dNTPs、MgCl，和PCRBuffer 等除模板以外的PCR体系组分应预先配制大样本量的预混物，以消除样品间的体系配制误差，增加体系配置精度，降低配制工作量。也可用等效的商品化预混日q酶来代替。每管加20L矿物油，PCR反应同时设置空白对照、阴性对照和阳性对照。8.3. 2. 2 PCR反应条件为，950C5 min;950C 40C保温。8.3.3 套式PCR第二步L dNTPs(各2.5 合酶及套式PCRPCR Buffer 40C保温。8.3.4 8.3.5 和147bp 8. 3. 5. 2 待测样测序结果同参考序列在514bp处无条带8. 3. 5. 3 结果判定可疑时，8.4 TaqMan荧光定量PCR30 s、680C45 s，30个循环;680C延伸5min，最后mol/L)各O.5L，0.5 0.5 U Taq DNA 鞋的dNTPs，MgCl2和间的体系配制误5 min，最后、废物等均不摇匀，制备8.4. 1 样品的TaqMan荧光定量PCR应在PCR反应区独立完成，避免造成区域间污染。8. 4. 2 TaqMan荧光定量PCR反应体系(25L)包括，2X预i昆液(2XPremixEx Taq) 12. 5L，157F引物(10mol/L)和157R寻|物(10mol/L)各1fLL. TaqMan探针0.5I儿，模板1L，用水定容至25L。除模板以外的PCR体系组分应预先配制大样本量的预混体系，以消除样品间的体系配制误差，增加体系配置精度，降低配制工作量。预混体系分装到PCR反应管后，加入模板DNA，瞬时离心，将PCR宫置于实时荧光定量PCR仪。同时设置阳性对照、阴性对照、空白对照。8. 4. 3 TaqMan荧光定量PCR反应条件为，950C30的950C5 s、600C30 s，40个循环。8.44 结果判定阴性对照和空白对照应无Ct值;阳性对照Ct值3 5，应进行次重复检验。若重复检验后结果相同，可判为阳性;否则，判为阴性。9 综合判定9. 1 可疑判定9.11 出现典型的临床症状(参见附录岛的对虾，组织病理学检验或套式PCR检验或TaqMan荧光定量PCR检验中任一结果为阳性，判定为虾肝肠胞虫病疑似，需要进一步确认。9.1 2 饵料生物样品，套式PCR检验或TaqMan荧光定量PCR检验中有一个结果为阳性，判定为虾肝肠胞虫核酸疑似阳性，应进行一次重复检验以确认。9. 2 确诊判定9.2 1 出现典型的临床症状(参见附录B)的对虾，组织病理学检验、套式PCR检验或TaqMan荧光定量PCR检验中有2个以上(含2个)结果为阳性，判定患虾肝肠胞虫病。9 2 2 无临床症状的对虾，组织病理学检验和/或套式PCR检验结果为阳性，且TaqMan荧光定量PCR检验为阳性，判定EHP感染。9. 2 3 元临床症状的对虾，组织病理学检验和套式PCR检验结果为阴性，判定虾肝肠胞虫病阴性。924饵料生物样品，套式PCR检验和TaqMan荧光定量PCR检验结果均为阳性，判定EHP核酸阳性;否则，判定阴性。9. 2. 5 TaqMan荧光定量PCR检测结果为阳性，但套式PCR为阴性，说明可能是肠胞虫属阳性结果，判为虾肝肠胞虫阴性。5 SC/T 7232-2020 附录A(规范性附录)试剂配制本附录中所有化学试剂，:徐特别注明外，全部为分析纯试剂。A.l CTAB溶液I、laClEDTA Tris-HCl 8.19 g 0. 744 g 1. 21 g CTAB 2 g 71 100 mL 配和l方法是在60mL水中顺序加入8.19g NaCl、0.744g EDTA, 1. 21 g Tris,O . 25 mLO. 3 mL浓HCl，使pH7. 58. 0，再加入2g CTAB，完全溶解后加水至100mL，其中含CTAB2%、NaCl1. 4 moL/L、EDTA 20 mmoL/L、Tris-HCl(pH7. 5)20 mmoL/ L, CTAB溶液使用前加疏基乙醇至终浓度为0.25%。A.2 抽提液I异戊醇、氮仿、1mol/L Tris-HCl饱和盼分别按体积比1 24 25的比例混合，4C密闭避光保存。A.3 抽提液E异戊醇与氯仿按体积比1 24的比例混合，4C密闭避光保存。A 4 TE缓冲液(pH8. 0) 1 mol/L TrisHCl(pH 8. 0) 10 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8. 0) 2 mL 加水定容至1000mL，高压蒸气灭菌，4C储存。A. 5 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) Tris 121. 1 g 水800mL 溶解后加入约42mL浓盐酸调pH接近8.0，冷却至室温，再用2.5 mol/L HCl调整pH至8.0，加水定容至1000mL，分装后，高压蒸气灭菌，室温储存。A.6 0.5 mol/L EDTA(pH 8. 0) 乙二胶囚乙酸二铀(EDTA-Na2.2H,Q) 18.6 g 水80mL 磁力搅拌，用2.5 mol/L NaOH调节溶液pH至8.0，完全溶解，定容至100mL。高压蒸气灭菌，室温储存。A.7 50XTAE电泳缓冲液Tris 242 g 6 冰乙酸0. 5 mol/L EDTACpH 8.0) 加水定容至1000mL.室温储存。A.8 1XTAE电泳缓冲液50XTAE电泳缓冲液加水定容至1000mL.室温储存。A.9 1%琼脂糖凝胶琼脂糖粉lXTAE电泳缓冲液将琼脂糖粉1)日人酸染料，均匀铺板57. 1 mL 100 mL 20 mL SC/T 7232-2020 60.C左右时，加入5L核，使用时应戴7 SC/T 7232-2020 B.l 虾肝肠胞虫病的发生与流行附录B(资料性附录)虾肝肠胞虫病虾肝肠胞虫病(Enterocytozoonhepato户enaeidisease)也称作肝胶腺微袍子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis, HPM) ，由虾肝肠胞虫(Enterocytozoon he归归户enaei, EHP)感染对虾所引发。养殖虾个体小，产量低，几乎没有销售价值，经济损失严重。虾肝肠胞虫可通过受精卵垂直传播，也可以通过污染养殖水体水平传播。对虾感染虾肝肠胞虫后难以消除，常常终身携带，该病现已经在泰国、中国、印度尼西亚、马来西亚、越南、印度等国广泛发生，严重影响对虾产业的健康发展。82 宿主凡纳滨对虾(Li印户enaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、日本囊对虾(Marsuenaeus japonicus)等对虾。83 临床症状患病对虾肝膜腺和肠道颜色较深，严重者肝膝腺萎缩，生长缓慢，个体明显偏小，感染群体生长差异明显增大。正常养殖条件下，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大量、急性死亡。体长相同时，发病群体的平均体重约为EHP阴性群体的70%。84病原虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatonaei, EHP)，属于肠胞虫科(Enterocytozooni-dae)、肠胞虫属(EnterocytozoOl1)，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生真菌。成熟A B b , d o 5m 的虾肝肠胞虫子包子呈椭圆形，具有极丝、l个细A箭头示肝脱脆组织经H-E染色涂片后的诸多徽抱子B经密JJ梯皮离心制骨的微抱于，C &. D箭头示肝腕腺小管上皮细胞细胞质中胞核和1个后位空泡，由几丁质构成的抱壁包的啃酸性包涵体，E肝肌跟小臂上皮细胞细胞质内的阜J固和晚Jj1J虾肝裹，大小为(1.1士O.2)mX (0.7土0.1)m，肠胞虫(a)以及成熟抱于(b).cPm:早期虾肝脑胞虫LPm:晚期虾肝肠胞虫.85 虾肝肠胞虫组织病理学图例见图B.1, 8 6 E旧的电镜图片见图B.2、图B.3，图片来源:乔毅，等，2018.南美自对虾肝肠胞虫的分离及形态学观8 注图片引自TourtipS, WO咱tripopS, Stentiford G D, ct al, 2009. E1/terocyZOO1/ heatope甜的，sp. nov. (Microsporida: En tCrocylozoonidae), a阳rasitcof the black tiger shrimpel/aeus mOI/-00011, (D:口再由Pcnaeidac):fnc structurc町dphyl啤cneticrcla tionshipsJ. Joumal of Invcrtcbratc Pathol咱y.102(1)，21-29图B.1斑节对虾肝膜腺小管上皮细胞内的虾肝肠胞虫显微照片SC/T 7232-2020 察口.中国水产科学.25(5):1051-1058 图B.2EHP抱子扫描电镜观察结果A 一二巳11B 0.5出.,C 圈B.3EHP袍子透射电镜观察结果B.7 TaqMan荧光定量PCR标准曲线见图B.4。图片来源:Liu Y-M.Qiu L. Sheng A-Z. et al. Quantitative detection method of Entero cytOZOOll he户to户enaeiusing Taqman probe real-time PCRJ. Journal of Invertebrate Pathology. 2018 (151): 191-196 40 35 t 30 c, 25 20 15 2 3 4 5 6 7 8 l.I!; Slartin o Slllndllrd咱FAM E=88.9% K=O.995 Slone=-3.621 y-int=45.180 5Q，初始棋板盘。扩增阀值循环数R相关系故E 扩增效率由标准dl1线所得回归方程为-3.6211og(5QJ+45.180 , R2O. 995 , E88. 9%. 图B.4 EHP TaqMan荧光定量PCR标准曲线9 9 SC/T 7232-2020 附录C(资料性附录)E盯扩增产物参考序列C.l 扩增虾肝肠胞虫抱子璧蛋白(SWP)基因514bp片段核酸序列TGCAG附TGGTTAAGGG1jAAGTAATTACGAGTTTG GCGGCACAAT TCTCAAACAT TTTCACCATT GGTCAAATAC AATTTCAAAC ACTGTAAACC TTAAAGCATT AAAAAGAGAC GATATTTACA CAGACACAGC ATTTGTAGGA TATGAGCTTT CAAATACAGT TGGAGACAAA CAGCTTAAAG AAGTrrGCAA TGATT1TIC T AAAGCATATG AATGCATATC AGAAGATAAA AGGAAAATGA ATGAAAAAAT GGGAGATATT TTTGAAGAAT TAAGTATTTT AAAAAAGAAG TGCAAACAAA TTGATCATCA ACGCAAAACT GTAAATAACC TAAGATATGA TTTAGAAGAA ATATTGCAAT CAAACATTTA TAAAGAAGAT CAAAAAGAAA ATTTAGAAAA AAAATTAGGA GAAACATCTG AAAAAACACT AGTAGAAATG GATGAATTTA TGCATTTAAG TATGATAAAT GGAGTAATCA AIGAAAA口GCAAAGACACAT CGTGI C.2 扩增虾肝肠胞虫抱子壁蛋白(SWP)基因147bp片段核酸序列10 甘T阳阳岛CAA口CAAAC附TTTCAATTGGTCAAA TACAATTTCA AACACTG TAA ACCTTAAAGC ATTAAAAAGA GACGATAm ACACAGACAC AGCATTTGTA GGATATGAGC T1rCAAATAC AGTTAGAC AAAC阳|ONON-gNh Hhv 势中国农业出版社出版北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码100125网址、.ccap.orn. co) 化学工业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9母提9晤印张l字数20千字2020年12月北京第l次印刷4峰开本880mmX1230mm 1/16 2020年12月第1版书号16109 8355 定价25.00元峰版权专有侵权必究举报电话[phone] SC/T