NY∕T 3188-2018 鸭浆膜炎诊断技术(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3188一2018鸭浆膜炎诊断技术Diagnostic techniques for duck serositis 2018-03- 15发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:郑福英、刘永生、陈启伟、宫晓炜。NY/T 3188-2018 I NY/T 3188-2018 引鸭浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌CRiemerellaanatiestifer)引起的一种鸭的接触性传染病，又称为新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合征、鸭疫巴氏杆菌病等。该病多见于1周龄8周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症，临诊上主要表现为精神沉郁，采食量下降，眼和鼻分泌物增多，头颈震颤或歪斜，共济失调。由j检眼观病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，部分病例出现关节炎，常引起雏鸭大批发病和死亡，目前已成为危害鸭养殖业的一种最常见的细菌病。鉴于目前我国关于鸭传染性浆膜炎的标准化诊断技术还是空白，因此我们制定了该标准，以便有效地诊断和监控该病。H 鸭浆膜炎诊断技术1 范围本标准规定了鸭浆膜炎的临床诊断和实验室诊断技术要求。本标准适用于鸭浆膜炎的诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件。凡是不注日期的引NY/ T 541 4.2 临床症状4.2. 1 急性病例4.2. 1. 1 多见于2周4.2. 1. 2 病鸭表现为倦怠，4.2. 1. 3 眼、鼻有分泌物。4.2. 1.4 濒死前出现神经症状，头4.2. 1.5 病程一般1d3 d。4.2.2 慢性病例4.2.2. 1 多见于4周龄7周龄的鸭。4.2.2.2 病鸭精神沉郁，食欲降低。NY/T 3188-2018 元素或蛋4.2.2.3 病鸭共济失调，瘟孪性点头或摇头摆尾，前仰后翻，呈仰卧姿态，有时头颈歪斜，做转圈或倒退运动，最后衰竭死亡。4.2.2.4 病程达1周或1周以上。4. 3 剖检病变4. 3. 1 纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。l NY/T 3188-2018 4.3.2 慢性病例常见腔距关节及甜关节肿胀，切开见关节液增多。4. 4 结果判定符合4.1中的某些流行特点，病鸭出现4.2中的临床症状和4.3中的眼观病变，可判断为疑似鸭浆膜炎。5 实验室诊断5. 1 样品采集与运输5. 1. 1 样晶采集5. 1. 1. 1 样品数量每个发病鸭群最少选择5只病鸭采集样品。5. 1. l. 2 血清选择具有临床症状的活鸭，从颈静脉或翅静脉元菌采集血液1mL2 mL，用常规方法分离血清。5. 1. 1. 3 组织若为活鸭，从颈动脉放血处死，元菌采集其脑、心脏和肝脏组织，分别放人元菌带有螺旋盖的离心管中。若为死亡鸭，则直接无菌采集其脑、心脏和肝脏组织。5. 1.2 样晶的运输与储存5. 1.2. 1 样品采集后，置于冰上冷藏送至实验室。5. l. 2. 2 血清和病料组织冻存于一200C以下。5. 2 鸭庭里默氏杆菌分离鉴定5.2. 1 仪器电子天平，光学显微镜，组织破碎仪，低温高速离心机，恒温培养箱。5.2.2 耗材载玻片，枪头，无菌2mL和5mL离心管，一次性培养皿。5.2.3 试剂灭菌双蒸水或去离子水，膜蛋白陈大豆培养基，膜蛋白陈大豆琼脂培养基，绵羊抗凝血，小牛血清，商品化细菌生化鉴定管，磷酸盐缓冲液(PBS，O.01 mol/L,pH 7.2)。相关试剂配制方法见附录A。5.2.4 样晶处理5.2.4. 1 无菌取鸭的脑、心脏、肝脏组织O.5 gl g，分别放人5mL容量的无菌离心管中，在天平上称量所取病料组织的重量(离心管的重量在加入组织前已经称量)。5.2.4.2 以2mL/管加人PBS(O.01 mol/L,pH 7.2)，以50Hz在组织破碎仪内研磨3min。5.2.4.3 吸取100L组织混悬液，放入2mL容量的元菌离心管中，用适量PBS(O.01 mol/L,pH 7. 2) 稀释至1: 10(/v)，混匀后取100L作为接种材料。5. 2. 5 细菌分离5.2.5. 1 将100L组织混悬液涂布于膜蛋白陈大豆琼脂(含5%绵羊血)平板上，倒置放于5%COz培养箱中，370C培养20h24 h。5.2.5.2挑取疑似鸭疫里默氏杆菌的单菌落接种到3mL膜蛋白陈大豆肉汤(含5%小牛血清)中，370C、200r/min振荡培养8h10 ho 5.2.5.3 用接种环蘸取少量菌液，划线接种于膜蛋白陈大豆琼脂(含5%小牛血清)平板上，再置于5%COz培养箱中，370C培养20h24 h。5.2.5.4 挑取符合鸭疫里默氏杆菌菌落特征的单菌落，再次接种到3mL膜蛋白陈大豆肉汤(含5%小牛血清)中，370C、200r/ min振荡培养8h10hoNY/T 3188-2018 5. 2. 5. 5 如5.2.5.3，再次划线接种于膜蛋白陈大豆琼脂(含5%小牛血清)平板上并培养。5.2.5.6 得到的菌落形态眼观一致，用革兰氏染色后观察到的菌体形态一致，视为得到纯化菌株。5. 2. 6 细菌形态观察5.2.6. 1 菌落特征元色、半透明、光滑、湿润、微隆起、呈露珠状、直径0.5mmlmm。5.2.6.2 草兰氏染色镜检革兰氏阴性小杆菌，多单个存在，少数成双，偶尔呈链状排列，可形成英膜，无芽抱，元鞭毛。5.2.7 细菌生化鉴定5. 2. 7. 1 细菌生化鉴定管中提前添加5%小牛血清，保证鸭疫里默氏杆菌良好的生长状态。5. 2. 7. 2 一般菌株不分解葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、煎糖、草糖、乳糖、半乳糖和棉子糖;少数菌株发酵甘露糖和麦芽糖。不能利用山梨醇、肌醇、卫茅醇、甘露醇。5. 2. 7. 3 不能利用水杨昔和西蒙氏拘橡酸盐。5.2.7.4 明胶液化试验、鸟氨酸脱竣酶活性试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验、平P试验均为阴性。5. 2. 7. 5 不产生呵|昧和硫化氢。5. 2. 7. 6 氧化酶、触酶试验阳性。5. 2. 8 细菌鉴定符合菌落特征，革兰氏染色阴性，并且符合生化反应特性的菌株，按照5.3做进一步鉴定。5. 2. 9 结果判定菌落特征明显，革兰氏染色阴性，符合生化反应特性的菌株，如果5.3鉴定结果阳性，则判定为鸭疫里默氏杆菌分离阳性。否则，判定为未检出鸭疫里默氏杆菌。5.3 PCR检测方法5. 3. 1 仪器PCR热循环仪，核酸电泳仪和电泳槽，全自动凝胶成像系统。5.3.2 耗材PCR反应管，移液器，枪头。5. 3. 3 试剂灭菌双蒸水或去离子水，组织DNA提取试剂盒，2XPCR反应预混酶，DL2000DNA分子质量标准，琼脂糖，1倍TAE缓冲液，引物CPAGE纯化，上下游引物浓度分别配成20pmol/L)。相关溶液的配制方法见附录B。可以采用引物1119F/ 1119R用于鸭疫里默氏杆菌核酸的检测，引物的靶基因、序列和扩增产物的大小见表1。目的正向引物反向引物5. 3. 4 样晶处理表1PCR检测鸭疲里默氏杆菌核酸的引物靶基因外膜蛋白AOmpA)基因外膜蛋白A(OmpA)基因序列(5-3) A飞TTGATGACTGGACTTGGTc寸.CACTACTGGAAGATCAGA 5. 3. 4. 1 膜蛋白陈大豆琼脂(含5%绵羊血)平板上的单克隆菌落，膜蛋白陈大豆肉汤菌液，均可以直接作为DNA模板。5.3. 4. 2 用组织DNA提取试剂盒从鸭的脑、心脏、肝脏组织中提取总DNA，提取步骤按照说明书进行。提取到的DNA冻存于一20.C，作为模板备用。3 NY/T 3188-2018 5.3.5 P 反应5.3.5. 1 对照设置每次进行PCR反应时均设置阳性对照和阴性对照。以鸭疫里默氏杆菌CVCC3966株作为阳性对照菌株，多杀性巴氏杆菌CVC53株作为阴性对照菌株。5. 3. 5. 2 反应体系50L/管，包括2XPCR反应预混酶25L，1119F和1119R引物各lL(引物终浓度为0.4pmol/ L)，元菌去离子水18L，模板5Lo5.3.5.3 PCR扩增程序940C 5rnin，35个循环5.3.6 PCR产物的电PCR反应结束产慨。苦捏捏Jrrtij翔L，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以1005.3.7 结果判品出12罩击者蟹草屋甚昌撞撞益慧理ErJE3311119 bp的6 4 附录A(规范性附录)鸭瘟里默氏杆菌分离鉴定溶液的配制A.1 膜蛋白陈大豆琼脂(含5%绵羊血)平板膜蛋白陈植物蛋白陈氯化铀15.00 g 5.00 g 5.00 g 琼脂15.00 g NY/ T 3188-2018 加950mL蒸馆水溶解，用HCl或NaOH调pH至7.3:l:0.2，再加蒸馆水定容至1000 mL. 121 oc、15 min高压灭菌。取出后室温冷却至450C500C，每1000mL培养液加元菌抗凝绵羊血50mL，轻轻摇匀，立即倾倒于直径90mm的细菌培养皿内，每个培养皿倒人15mL20 mL，待其凝固并冷却至室温后，用封口胶封边，倒置40C保存，1周内使用。A.2 肢蛋白陈大豆肉汤(含5%绵羊血)膜蛋白陈15.00 g 植物蛋白陈5.00 g 氯化铀5.00 g 加950mL蒸馆水溶解，用HCl或NaOH调pH至7.3土0.2，再加蒸馆水定容至1000 mL, 121 oC、15 min高压灭菌，40C保存，1月内使用。临用前加入5%的绵羊抗凝血。A.3 PBS(O. 01 mol/L,pH 7. 2) 氯化铀(NaCD氯化饵(KCD磷酸二氢梆(KH2P04) 8.00 g 0.20 g 0.20 g 磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 2. 90 g 加入去离子水800mL，待固体试剂全部溶解后，定容至1000mL，用HCl或NaOH调节pH至7.2，1210C、30min高压灭菌，40C保存。5 NY/ T 3188一2018附录B(规范性附录)PCR试验溶渡的配制B. 1 50倍TAE电泳缓冲渡Tris碱242.00g EDTA 37.20 g 冰乙酸57.1 mL 加入去离子水800mL，待固体试剂全部溶解后，定容至1000mL。使用前用去离子水将50倍TAE电泳缓冲液稀释至1倍使用浓度。B. 2 1%琼脂糖电泳凝胶板的配方和制备琼脂糖19 1XTAE电泳缓冲液100mL 将琼脂糖放人1XTAE电泳缓冲液中，加热溶化，温度降至60.C左右时加人10mg/mL澳化乙键CEB)3L5L，混匀后均匀铺板，厚度为3mm5mm。6 4 ON|町HLE中华人民共和国农业行业标准鸭浆膜炎诊断技术NY/ T 3188-2018 * 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125阿址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销* 9导* 开本880mmX1230mm 1/16 印张O.75 字数15千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4458 * * 定价18.00元版权专有侵极必究举报电话[phone]