不同稀释介质对乙型肝炎病毒表面抗原定量检测的影响.pdf

实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine,Aug.2023,Vol.41,No.4不同稀释介质对乙型肝炎病毒表面抗原定量检测的影响陈明心，王炜，张岱，任伟宏（河南中医药大学第一附属医院,河南郑州450 0 0 0)摘要：目的确定在乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)定量检测中影响稀释结果的主要物质成分,为HBsAg稀释液的选择提供思路。方法分别使用生理盐水,50 g/L小牛血清白蛋白(BSA)、15g/L 小牛血清球蛋白(BCG)以及阴性血清对10 1份HBsAg阳性样本进行3倍稀释,计算稀释带来的偏差。分别将BSA和BGG配制成不同浓度稀释液,对10 份HBsAg阳性样本进行3倍稀释,分析稀释后检测结果差异。分别使用生理盐水,50 g/L的BSA、15g/L 的BGG以及阴性血清对15例HBsAg阳性样本进行3倍稀释，然后分别将反应总时间控制在32 min、6 2 mi n、7 7 mi n 和9 2 min，分别计算6 2 min、7 7 mi n 和9 2 min检测结果相对于32 min检测结果的比值（即增幅）,比较不同稀释组在9 2 min时的增幅。结果15g/L的BGG稀释所得的回收率偏差最小。BSA不同浓度之间的稀释结果无明显差异，而BGG不同浓度之间稀释结果成负相关。15g/L的BGG稀释组在92min相对于32 min的检测浓度的增幅最大。结论15g/LBGG作为HBsAg稀释液效果较为理想。关键词：乙型肝炎病毒表面抗原；稀释液；小牛血清球蛋白中图分类号：R446.66文献标识码：A文章编号：16 7 4-112 9(2 0 2 3)0 4-0 39 5-0 5D0I:10.3969/j.issn.1674-1129.2023.04.004Effects of different dilution media on quantitative detection of HBV surface antigen CHEN Minxin,WANG Wei,ZHANGDai,REN Weihong.The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine,Henan,Zhengzhou,450000,China.Abstract:Objective Determine the main substance components that affect the dilution results in the quantitative detection ofhepatitis B virus surface antigen(HBsAg),and provide ideas for the selection of HBsAg dilutions.Methods A total of 101 HBsAgpositive samples were diluted three times with normal saline,50 g/L bovine serum albumin(BSA),15 g/L bovine serum globulin(BGG)and negative serum respectively,and the deviation caused by dilution was calculated.BSA and BCG were prepared into dif-ferent concentrations of diluents,and 10 HBsAg positive samples were diluted three times,and the difference of detection resultsafter dilution was analyzed.Fifteen HBsAg positive samples were diluted three times with normal saline,50 g/L bovine serum al-bumin(BSA),15 g/L bovine serum globulin(BGG)and negative serum,respectively.Then the total reaction time was controlled at32 min,62 min,77 min and 92 min,respectively.The ratio of the results of 62 min,77 min and 92 min to the results of 32 min(ie.,increase)was calculated,and the increase of different dilution groups at 92 min was compared.Results The deviation of 15g/L BGG group was the smallest.There was no significant statistical dfference compared with the negative serum dilution group,while the dilution results between different concentrations of BGG are negatively correlated.The 15 g/L BGG group has the largestincrease in the detection concentration at 92 min compared to 32 min.Conclusion 15 g/L BGG is more effective as HBsAg diluent.Key words:Hepatitis b virus surface antigen;Diluent;Bovine serum globulin395.实验研究在目前临床检验工作中，血清HBsAg浓度已经可以使用全自动化免疫检测系统进行检测，但是很多检测体系的检测范围(例如雅培)仅仅为 50 0 g/L)51份，各自随机寻找阴性血清将其进行稀释配制成混合血清，该51份混合血清浓度覆盖0.2 50 0 g/L范围。1.2稀释液选取四种稀释液：(1)0.8 5%0.9 0%的生理盐水；(2)BSA，可根据需要配制成不同浓度；(3)BGG,可根据需要配制成不同浓度；（4)随机阴性血清(要求HBsAg和HBsAb同时为阴性)1.3仪器光激化学发光全自动免疫分析仪器（Li-CA500,博阳公司)1.4试剂LiCA500配套HBsAg检测试剂,包含试剂A和试剂B,以及LiCA检测系统共用通用液1.5实验方法1.5.1不同稀释介质对稀释结果的影响将10 1份HBsAg阳性样本分别用生理盐水,50 g/LBSA、15g/LBGG以及随机阴性血清进行3倍稀释。稀释方法为病人血清30 L+稀释液6 0 L,充分混合均匀后，使用LiCA500检测。按照试剂配套说明书，检测过程为加人2 5L样本、2 5L试剂A、2 5L试剂B,反应15min后，加人17 5L通用液，反应17min后,由仪器检测发光值,再根据校准曲线自动获得HBsAg浓度，将以上稀释后得到的检测结果乘以3，得出通过稀释后计算获得的HBsAg浓度（以C1来表示）,而未稀释的原始样本直接检测的浓度以C2表示，根据CLSIEP7-A2文件使用公式计算稀释检测带来的偏差:D=l(C1-C2)/C2I100%,设定D在2 0%以内为合格，观察各稀释组有多少结果可以达到合格。1.5.2同一蛋白稀释介质不同浓度对稀释结果的影响选取10 份HBsAg阳性样本（其浓度覆盖0.2500g/L范围）,分别用8 0 g/L、6 0 g/L、40 g/L、10 g/L的BSA,以及2 0 g/L、15g/L、10 g/L、5g/L 的BGG进行稀释，将不同浓度BSA以及不同浓度BGG稀释后得到的结果分别除以未稀释时的相应的原始检测结果，得出稀释3倍后的检测结果相实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine，A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4对于未稀释检测结果的降幅，对不同浓度的同种基质的稀释液之间的稀释结果进行相关分析。并将其分析结果进行比较。1.5.3动力学分析选取15份HBsAg阳性样本（其浓度覆盖0.2 50 0 g/L范围）分别用生理盐水、50 g/L BSA、15g/L BCG、以及阴性血清稀释3倍，稀释后上机进行检测，在加人通用液后，分别将孵育时间控制在17 min（总反应时间为32min）、47 mi n（总反应时间为6 2 min）、6 2 mi n（总反应时间为7 7 min）和7 7 min（总反应时间为9 2min）进行检测。并分别用总反应时间6 2 min、7 7min和9 2 min时测得的发光信号值除以总反应时间32 min时测得的发光信号值,计算各自的增幅。1.5.4统计分析使用统计软件SPSS24.0进行统计分析，不同稀释介质对10 1例样本稀释结果采用单因素方差分析并用LSD法做两两比较。同一种蛋白不同浓度稀释结果采用回归分析。动力学结果，不同介质稀释组9 2 min相对于32 min的增幅采用单因素方差分析,并用LSD法做两两比较。2结果不同稀释液稀释后偏差在2 0%以内的样本例数见图1。15g/LBGG稀释后偏差在2 0%以内者最多。各不同稀释液稀释所得回收率偏差结果如图2,通过单因素方差分析，非混合样4组稀释结果的F为35.8 30,P为0.0 0 0,混合样4组稀释结果的F为9 1.7 0 6,P为0.0 0 0,说明无论混合样本还是非混合样本，4组稀释得到的回收率偏差整体均有显著性差异,进一步做LSD检验,15 g/L BGG和生理盐水组以及50 g/LBSA组均有显著性差异,无论是非混合样本还是混合样本均是15g/LBGG稀释所得回收率偏差最小。对BSA不同浓度与各浓度稀释后的降幅之间90（%）%生理盐水图1不同稀释组回收率偏差小于2 0%的样本所占比例非混合血清混合血清50g/LBSA15g/LBGG随机阴性血清实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory MedicineAug.2023Vol.41,No.4200-（号）%150100500120-397.80+75706560-5550生理盐水50g/LBSAA20gBSA3x15g/LBGG随机阴性血清40gBSA3x70（）60504060gBSA3xABOgBSA3x100（）%806040200图2 10 1例样本经4种稀释液稀释后回收率偏差的对比注：A为50 例非混合血清；B为51例混合血清（*代表P0.01)。进行相关分析，其相关系数为-0.0 8 8,P为0.58 9，无明显差异；对BGG不同浓度与各浓度稀释后的降幅之间进行相关分析，其相关系数为-0.7 44,P为0.000，有明显差异。当BSA作为拥挤分子时随着稀释液中BSA浓度的增加，结果仅仅出现了轻度的下降,并未出现明显大幅度的改变。当BGG作为拥挤分子时随着稀释液中BGG浓度的增加，从5g/L增加至2 0 g/L时，稀释结果下降了接近50%。见图3。4组稀释液对样本进行3倍稀释后，6 2 min、77min、9 2 m in 各自相对32 min的增幅见图4。在77min至9 2 min时间段的增幅较为接近，从而认为在9 2 min时,抗原抗体结合反应接近达到平衡，本次研究拟将9 2 min作为反应平衡点。4个稀释组9 2 min相对于32 min的增幅，见图5,通过单因素方差分析，F为2 7.358,P为0.0 0 0，说明4组在9 2 min得到的增幅整体有差异，进一步进行LSD检验,15g/LBGG组和其他组之间均有明显差异,结合图3所示,可以看出在9 2 min时,生理盐水稀释组和50 g/L稀释组的增幅接近,15g/L3020-10注：A为不同浓度BSA稀释；B为不同浓度BGG稀释。BGG稀释组的增幅是最大的。生理盐水50g/LBSAB5gBGG3x图3两种蛋白介质不同浓度稀释后的降幅15g/LBGG随机阴性血清10gBGG3x2.2生理盐水50g/LBSA15g/LBGG2.0随机阴性血清1.8-1.61.4-1.2-1.0-3讨论目前已经证实，在稀释液中存在的各种反应成分以外的基质成分会对反应速度造成影响，通常将这些基质成分称为拥挤分子团,稀释液中的拥挤分子如果足以改变抗原抗体反应的速度，则可能造成HBsAg稀释结果的不准确。血清中含量最多的成分是蛋白质,浓度可达到6 0 8 0 g/L,由此推测，有可能是血清中其他蛋白质作为拥挤分子对HBsAg和其抗体结合速度造成了影响。血清蛋白质主要成分为白蛋白和球蛋白，还有少部分的球蛋白和球蛋白，因此分别选择BSA和小牛血15gBGG3xB32min62min反应时间图4HBsAg阳性样本经4种稀释液稀释后延长反应时间相对反应32 min增幅20gBGG3x77min92min3982.472.0-1.6-1.2-图5不同稀释组9 2 min相对于32 min的增幅注*代表P0.01。清球蛋白作为稀释液成分，模拟人血清不同种类蛋白质来观察其对稀释效果的影响。由于人血清中白蛋白含量8 约为40 6 0 g/L，平均浓度为50g/L,因此将 BSA稀释液浓度控制在50 g/L。人血清中 IgG含量(约为为8 16 g/L,平均浓度约为12 g/L,而血清中IgG含量约占球蛋白的8 0%,因此将BGG稀释液浓度控制在15g/L。为了更好地证明稀释液的稀释效果,除了随机选取了50 例在0 500ng/L的HBsAg阳性样本外，还将较高浓度的HBsAg阳性血清用其他阴性血清进行稀释配制成混合血清，将混合血清浓度稀释在0.2 50 0 g/L的范围内。一份混合血清往往代表了两到三份样本的综合情况，可更好地减弱一些随机基质效应。从本次实验的结果看，相对分子量较小的BSA和生理盐水的稀释效果接近，回收率偏差远不能达到预期。而相对分子量较大的BGG则稀释效果较好，近8 0%的样本可以达到8 0%12 0%范围以内。阴性血清稀释效果出现了较大差异。将BSA和BGG的梯度拉开后,BSA不同浓度的稀释液稀释结果相差不大，浓度达到8 0 g/L后略有下降。而BCG浓度从5g/L增加至2 0 g/L时，稀释结果下降了约50%。由此，可认为模仿人球蛋白的BGG在稀释过程中是影响稀释效果是否能够符合预期的主导影响因素。造成该种现象的原因可能是，球蛋白由于分子量较大，因此是血液粘度的主要决定因素 10-。而血液粘度决定了分子的扩散受到的摩擦力从而影响扩散速度，且血清中的HBsAg大多不是单纯的游离形式存在的蛋白,而是病毒小圆颗粒表面的蛋白质 2,大颗粒物质更容易受到摩擦力的阻滞作用，导致抗原抗体实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine,Aug.2023,Vol.41,No.4相遇的速度更慢。作为对比,蛋白成分BSA并非影响分子扩散的主要影响因素。为了进一步验证BGG对扩散的影响。本次实验进一步进行了动力学观察。针对不同稀释液稀释的样本，采用增加孵育时间的方法观察其检测结果的变化。如果是影响扩散的情况下,则在较早的时间点中，抗原抗体相遇较少，形成的复合物也较少，但是抗原抗体的总量并未发生变化，只是结合速度发生了改变，因此延迟孵育时间，使其能够充分结合而达到反应平衡之后，则在第一次检测生理盐水50g/LBSA15g/LBGG随机阴性血清到达到反应平衡这段时间中BGG稀释的样本会有更多的抗原抗体复合物形成，因此其增幅与生理盐水稀释样本以及BSA稀释样本相比明显较大，与随机选取的阴性血清相比也较大，这可能和阴性血清稀释结果不稳定的情况有关，里面可能还会存在一些未知因素的干扰，这些仍需进一步研究。由以上推测,BGG稀释组中HBsAg和其抗体的整体扩散速度应低于生理盐水稀释组和BSA稀释组,BGG可能具备和血清中球蛋白较为接近的控制HBsAg和其抗体扩散的能力，从而得到了较好的HBsAg定量稀释结果。参考文献1Jaroszewicz J,Calle Serrano B,Wursthorn K,et al.Hepatitis Bsurface antigen(HBsAg)levels in the natural history of hepatitis Bvirus(HBV)-infection:a European perspectiveJ.J Hepatol,2010,52(4):514-522.,2Pfleger C,Schloot N,ter Veld F.Effect of serum content and dilu-ent selection on assay sensitivity and signal intensity in multiplexbead-based immunoassaysJ.J Immunol Methods,2008,329(1-2):214-218.3JFeng X,Chen A,Wang J,et al.Understanding Protein Diffusion inPolymer Solutions:A Hydration with Depletion ModelJ.J PhysChem B,2016,120(38):10114-10123.4吴震,宗婧,李晨曦,等.基于光激化学发光均相免疫检测技术的黄曲霉毒素检测方法研究.光学技术,2 0 19,45(0 1):117-12 3.5侯寒进,蒋佳利,冯文卓,等.光激化学发光法在D-二聚体单克隆抗体筛选中的应用 J.吉林医药学院学报,2 0 2 0,41(0 6):46 0-46 1.6钱明,陈红涛,李文华,等.微粒子酶免疫检测法测定血中FK506 浓度的影响因素 J.中国现代医生,2 0 0 9,47(30)9 8-9 9.7Nicoud L,Jagielski J,Pfister D,et al.Kinetics of Monoclonal Anti-body Aggregation from Dilute toward Concentrated ConditionsJ.JPhys Chem B,2016,120(13):3267-3280.8丁红香,张维策,倪莉,等.溴甲酚紫法测定血清白蛋白参考范围调查 J.国际检验医学杂志,2 0 0 6,2 7(0 1):9 2-9 3.9李雷勇,吴爱花,田岳风,等.不同灸法对免疫抑制免免疫球蛋白浓度的变化分析 J.中华全科医学,2 0 16,14(12)：19 8 0-19 8 2.10JMeyer ER,Kress JD,Collins LA,et al.（下转第0 40 3页）实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4间而出现截然不同的结果，放置30 min后提取的结果阳性率却是最高的，这说明了样本提取前不同的处置方法对假阴性结果有一定的影响。实验前标本保存液总量是3mL，实验前有无振荡对结果的影响不大，结果与病毒核酸载量以及与在采样管中的悬浮性有关。另一方面,体外诊断试剂的分析敏感性是有极限的8,原始标本中病毒数量低于一定程度，就很可能在核酸扩增检测的反应体系中没有病毒核酸，试剂也就无法检出，试剂因素也是影响实验结果的重要因素之一，尤其是当样本有不同的处理方式时，试剂因素对实验结果的影响就突显出来了。有报道称,COVID-19 患者在症状消失后的一段时间内仍可检测出病毒的RNA9-10。冯毅叫报道了湖北武钢第二职工医院38 例确诊病例同步检测咽拭子核酸检测和胸部CT，第1次核酸检测阳性病例9 例，第2 次核酸检测结果阳性病例2 5例,第3次核酸检测结果阳性病例4 例。LAN等 12 研究证实，4例COVID-19患者在出院5 13d后出现核酸“复阳”。COVID-19患者经过治疗症状消失后，排毒仍继续，体内仍携带较低滴度的病毒，这可能与病程不同阶段的核酸载量有关。另一方面，核酸检测试剂的灵敏度、实验人员的操作方法等实验因素也会导致核酸漏检和假阴性，使部分患者在痊愈前出院，导致出现“复阳 现象13-14。有研究分析了出院前连续核酸检测阴性次数对出院后复阳的影响，结果显示连续3次及以上核酸检测阴性可大大降低复阳比例，这对今后的疫情防控有很好的提示作用 5。新型冠状病毒核酸检测应严格按照SOP进行实验，采样使用灭活采样管，尤其是疾病治疗后期和疑似病例的样本应充分震荡并静置30 min后再进行下一步提取和扩增实验，这样做能有效避免气溶胶的发生，也对避免假阴性结果具有一定的应用价值。我们医院收治的新型冠状病毒患者数量不多，本研究存在一定的局限性，研究结论尚需403.进一步验证。参考文献1WANG D,HU B,HU C,et al.Clinical characteristics of 138 hospi-talized patients with 2019 novel coronavirus infected pneumonia inwuhan,ChinaJJ.JAMA,2020,323(11):1061-1069.2Yueying W,Song W,Zhao Z,et al.The impacts of viral inactivat-ing methods On quantitative RT-PCR for COVID-19J.Virus Res,2020,285:197988.3段秀枝,王旭楚,俞攀,等.病毒灭活处理对 2 0 19 新型冠状病毒核酸检测弱阳性结果的影响 J.中华检验医学杂志,2 0 2 0,43(4):358-363.4李彩玉,陈梦媛,张师音,等.新型冠状病毒核酸检测假阴性原因分析及控制要点 .厦门大学学报(自然科学版),2 0 2 0,59(3):310-316.5陈翊,连广琬,郑玲玲,等.含胍盐灭活保存管在2 0 19 新型冠状病毒实时荧光PCR检测中的应用 J.中华临床实验室管理电子杂志,2 0 2 0,8(2):9 4-9 9.6严谨,陈小凤,熊金萍,等,不同灭活温度对新型冠状病毒核酸检测的影响 J.检验医学与临床,2 0 2 1,18(2):2 14-2 16.7秦维超,孙贵银,张运洪,等.3 例 COVID-19 出院后核酸复检阳性患者的检测分析 .病毒学报,2 0 2 0,36(4):554-558.8张瑞,李金明.如何减少新型冠状病毒核酸检测的假阴性 .中华医学杂志,2 0 2 0,10 0(11):8 0 1-8 0 4.9Zhou F,Yu T,Du R,et al.Clinical course and risk factors formortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan,China:aretrospective cohort study JJ.Lancet,2020,395(10229):1054-1062.10JArashiro T,Furukawa K,Nakamura A.COVID-19 in 2 personswith mild upper respiratory tract symptoms on a cruise ship,JapanJ.Emerg Infect Dis.2020,26(6):1345-1348.11冯毅,袁连方,郑冲霄,等.CT在核酸检测在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用 J.广东医学,2 0 2 0,42(5):440-443.12JLAN L,XU D,YE G,et al.Positive RTPCR Test Results in Pa-tients Recovered From COVID 19JAMA,2020,323(15):1502-1503.13周丹,何进才,黄涛,等.18 44 例新型冠状病毒核酸检测及生物安全防护实践 J,实验与检验医学,2 0 2 0,38(2):2 12-2 14,2 30.14胡星星,倪岚,陈毅斐,等.新型冠状病毒肺炎患者恢复期核酸检测复阳的临床分析 .武汉大学学报（医学版)2 0 2 1,42(6):8 6 7-871.15常颜信,徐明霖,傅晓辉,等.严重急性呼吸综合征冠状病毒2 咽拭子核酸检测法假阴性调查分析,第二军医大学学报,2 0 2 0,41(6):592-595.(收稿日期2 0 2 1-0 4-13)(上接第0 39 8 页）Effect of correlation on viscosity and diffusion in molecular-dynamicssimulations J.Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys,2014,90(4):043101.11JLo MS,Newburger JW.Role of intravenous immunoglobulin in thetreatment of Kawasaki diseaseJ.Int J Rheum Dis,2018,21(1):64-69.12Peiffer KH,Kuhnhenn L,Jiang B,et al.Divergent preS Sequencesin Virion-Associated Hepatitis B Virus Genomes and SubviralHBV Surface Antigen Particles From HBV e Antigen-NegativePatientsJJ.J Infect Dis,2018,218(1):114-123.(收稿日期2 0 2 1-0 1-14)