SN∕T 5373-2021 大灰蛞蝓检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国检验检疫行业标准SN/T 5373-2021 大灰虫百揄检疫鉴定方法Detection and identification of limxmximus Linnaeus, 1758 2021-06-18发布2022-01-01实施中华人民共和国海关总署发布-NON-的hSH军巾华人民共租同出入境检验检疫行业标准大灰蝠蛐检疫鉴定方法SN/T S:i7:i-2021 争斗巾同海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东问环南路甲l号(100023)编辑部:[phone]-7531网址 /16 印张l字数23千字2021年7月第一版2021年7月第一次印刷印数1-S00争夺书号155175 666定价16.00元SN/T 5373-2021 SN/T 5373-2021 目IJ1=1 木文件按照GB/T1. 1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容口j能涉及专利。本文件的发布机构不承担识另IJ专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出)H=l门。水文件起甲气位:1华人民共和国福州;每天。本文件主要起草人:五rd、周卫)11、切l美玲、陈在林、二E.j、林同|武。I 大灰虫E揄检疫鉴定方法1 范围本文件规定了大灰据揄lirna.rma.rimusLin且nr旧E叽凹u川1本文件适用于大灰虫蝠吕揄的检疫鉴定o2 规范性引用文件SN/T 5373-2021 下列文件巾的内容通过文巾的规范性引用而构成本文件必不可少的条款O其巾，注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件OSN/T 3067-2011 软体动物常规检疫规范3 术语和定义SN/T 3067-2011界立的以及下列界边的术语不叫:义边用于水文件。3. 1 呼吸孔blowhole 为气本进山孔迫，位于体右侧外套!出边缘非后位置。3.2 生殖孔gonopore 生殖系统的开口，位于右触角基部稍后位置。3.3 外套膜mantIe 为陆生软体动物躯体背部皮质层皱榴延伸而戚，是一层覆盖内脏囊的膜状物，肺血管网密布其上，可行呼吸作用，且能分挝、碳眼钙形成贝壳。3.4 3.5 3.6 注:软体动物外套膜通常向3层组成:即靠近体外的表皮层.能分泌碳酸钙形成贝壳;巾间的皮层，由肌肉与结缔组织交织而成，靠近内脏圆的皮层.常生有纤毛3阴茎penis 阴茎系统一般由阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌和鞭状体组成.其中后二气者常因种类不同而缺失。注:大灰师揄元鞭状体3软体soft body 蝠揄柔软的身体O注:软体的颜色和长度口l用了分类。盾板scutum 蝠揄退化的贝壳。SN/T 5373-2021 3. 7 尾崎tail keel 尾部中央的崎状突起。注f与此种类的尾山奇发达，口l直达外交膜后缘o4 基本信息中文名:大灰蜡捕;豹纹括揄英文名:grcat grcy slug; Lcopard slug 学名:1i1na:rlna.TimLinnacus. 1758 异名:lim工门nereusLister, 1678; limax cinereus M uller. 1774; limacellaarma Brard, 1815; lima:rtcultus Nu口neley，1837; lim.a工cellriusLes吕onael Polonera. 1882; linl、carbonr1US fbaicu. Jaeckel, 1954 分类地位:软体动物门Mollusca.腹足纲Gastropoda，柄眼日Stylommatophora，括蛐科Limacidae，虫阳市属L川axIinnaeus. 1758。如揄属有35个种，大灰括蝙的近似种有4个.分别为康氏如蛐L.nemenosi Bottgcr, 1882、黄峙蛐L.jlvus Linnacus, 1758、杂色括揄L.aeoli们lUSGiusti. 1973 和维罗纳峙蝙L.veronensis LessonaPollonera. 18820大灰如揄的其他信息参见附录人。5 万法原理传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据O软体、生用系统形态特征和分子生物学特性是实验室鉴定的主要依据。6 器具和试剂6. 1 仪器和用具仪器:体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、实时荧光PCR仪、低泪冰箱。用具:放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、内瓷盘、培养皿、慑子、剪刀、显微慑子、显微剪刀、做针、解剖蜡盘、标签、移液检、1.5mL离心管、八连排荧光PCR反应管O6.2 试剂|综另有规定外，所有试剂均为分析纯。乙醇、硫酸镇、动物基因组DJ八提取试剂盒、实时荧光PCR检测试剂、ddH，()。7 现场检疫对来自疫|又(参见附录的的集装箱、木质包装材料应重点检查，仔细观察集装箱的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有脑血曲。注意阴暗、潮湿、蔽光处的检查，用于电筒仔细寻找峙蛐的行迹。对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加丁牛的植物性原材料也应认真检查，对可能被峙蝙污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。虫古揄爬行过后，会留下Htbd鸟的丝带状如被痕迹，这是判J.二是否有如揄污染的甲虫依据。发现括脯，装入塑料自封袋或标本瓶带同实验室做ill一步的检验鉴定。发现盆景等携带土J装或其他细碎衬垫2 SN/T 5373-2021 材料时，可过筛检1t是否有卵卫li:幼体。8 实验室鉴定8. 1 饲养单独查获的卵粒，按照SN/T3067-2011中8.1方法，将其孵化和饲养为成年插揄后，再做进一步的鉴定。8.2 测量、观察和软体解剖用游标卡尺测量括揄软体的长度、卵粒的直径。用肉眼或放大镜或体书显微镜仔细观察卵和蝠揄的形态特征o将闷杀处理后的标本，按照SN/T3067-2011中8.3.1进行软体解剖，分离归生殖系统。8.3 蝠蛐属鉴定特征软体中型至大型，外套膜大约覆盖软体的1/4。呼吸孔位于体右侧外套膜边缘靠后位置.尾山奇短小.清晰可见。阴茎长.管状，卷曲缠绕，无鞭状体。阴茎和阴茎牵引肌交叉相连。输精管插入阴茎顶部靠上位置。8.4 大灰蝠蛐鉴定特征8.4. 1 W 卵圆形，相互粘连呈簇状.透明，有弹性.颜色硝发黄，直径为4mm5.J mm(参见罔B.I)。8.4.2 软体体长100mm200 mm，分布较多的不连纹的纵向条纹，国部有一较短hl峙，约30mm60 mmo 软体底色多变，呈浅灰色，褐色或者黄白色，常常布满大的黑色斑点，斑点形状多变。腹足底部灰色或者黄灰色.边缘颜色比较浅，布满一排黑色结节。触角细长。生殖孔位于:t触角基部稍后位置。外套膜长度约是软体的30%。盾板椭圆形，大小约为13mmX7mm，颜色与软体一致。盾板前部圆润.后部隆起成角，可身体蠕动时形成弓形。呼吸孔位于体右侧外套膜边缘靠后位置。在背部中线和呼吸孔之间有21条:-l6条榈皱。茹液无色，结性小(参见图B.2)。8.4.3 生殖系统两性腺长，通过两性管与输精卵管相连。输精卵管粗而卷由.向下延伸分成输精管及输卵管。输桔管捕入阴茎末端上部。阴茎长，上部连接一个粗壮的阴茎牵引肌，无鞭状体。阴茎下部与输卵管直接相连，阴道不明显。受精去柄极短，受精茸小(参见图B.3)。8.4.4 实时荧光PCR检测以大灰断蝙为阳性对照，其他非大灰崎揄为阴性对照.同时以ddH2()代替模板作为空白对照进行实时荧YlPCR检测(参见附录。8.5 大灰蜡蛐与近似种的区别大灰括蝙的近似种有4个，分别为康氏恬蛐L.conemenosi Bottgcr, 1882、黄峙脯L.jlavus Lin naeus, 1758、杂色峙蛐L.aeoZiallus Giusti, 1973和维罗纳虫阳市L.verOll叩门卫LessonaPollonera，SN/T 5373-2021 1882。大灰括附与近似种的l又川参见附录Do9 结果判定9.1 形态学方法以软体外形和生殖系统特征为基本鉴定依据，并注意与近似种鉴别(参见附录D)。对于软体外形典型的个体符合8.4.2判定为大灰蝠揄;对于软体外形有变异的个体.需同时符合8.4.2和8.4. 3判定为大灰蝠揄。9.2 实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下.则:待测样品的Ct值二40时，判定为非大灰姑揄;待测样品的Ct值35时，判定为大灰断捕;一一待测样品的35Ct值40时，应重新进行测试;如果重新测试的Ct值二40时，判定为非大灰自阳市;如果重新测试的Ct值40时.则判定为大灰峙蝙。10 标本处理和保存10. 1 标本处理且:!照SN/T3067-2011 0 10.2 保存时间经过鉴定的大灰据揄标本应制作成浸也标本永久保存，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。4 .1 寄主附录A(资料性)大灰据蛐的寄主、地理分布及危害性无特定的寄主.主要取食各种疏菜、花卉、腐殖质，枯死的植物以及菌类、藻类等。.2 地理分布SN/T 5373-2021 大灰括蛐起源于欧洲，主要分布在英国、爱尔兰、比利时、荷兰、卢森堡、法国、瑞士、保加利亚、捷克、波兰、斯洛伐克、匈牙利、德同、澳大利亚、斯堪的纳维亚、挪威、瑞典、法罗群岛.拉脱维亚，立陶宛，白俄罗斯，乌克兰等国家。入侵地区:北美洲的东海岸和西海岸地区，包括纽波特、罗德艾兰州、匹兹堡、加利福尼亚、蒙大纳、安大略、新斯科舍、纽芬兰等地。.3 生物学特性及危害特点大灰括蛐经常在人类居住地附近出没，如草丛、花同、地下室等。该如蝙无群居性，常栖息于花同、潮温隐蔽的灌木丛中，石块和落叶下.或其他阴暗潮湿的地方，尤其是偏好于潮湿的地下室。该虫古揄具杂食性，主要取食各种蔬菜、花卉、腐殖质.枯死的植物以及菌类、藻类等.可以15cm/ min的爬行速度捕食其他括自由。该虫舌蝙还可严重危害农作物幼苗，被美国的弗罗里达州和俄勒冈州的农业局列为重要的农业危险性有害生物O此外.大灰插揄是线虫Agfafle:riLis、AngiostomaLiIacis ,AngiostrongyLus Is!ancenS1S手QA1lp;iosLro川.yLusCU1l!01l川川的中间奇主，误食后可引起呕吐、胃疼、脑膜炎等疾病。SN/T 5373-2021 6 附录B(资料性)大灰括蛐形态特征大灰虫刮自形态特征见罔B.l、罔B.2、罔B.3。图B.1 卵形态特征仔|向http曰:!/images. app. goo. gl/5wWmmDhNBwo6rrbZ9) 图B.2成年插曲俞软体形态特征(寻|向https:/cn.wikipcdia. org/wiki/Limax_maximus) SN/T 5373-2021 说明RC 受精褒;PBC 受精囊柄，VD 输精管;。v输卵管;P 阴革;PRM一一191茎来寻|肌;so 输精卵管;HG 两性腺;HD 两性管;AG 蛋内腺图B.3生殖系统形态特征(仿ScharffR F, 1891) 7 SN/T 5373-2021 C. 1 DNA t.lUl 附录C(规范性)大灰蝠蛐实时荧光PCR检测取腹足肌肉约30mg，用动物基|人|组DJA试剂盒方法按照商品化i式剂盒说明书要求提取DNAoC.2 引物及探针LMF: 5 -CCTGGAGGTGCCATGGGTTT-3。L岛1R:5 -八CG八CGGGCTCG八TGTG八八八-3。L肌1P:5 -FAM-ACGCCGCGCCGTCGTCTCCA-BHQl-3。C.3 反应体系反应体系为25.uL:其中DNA模板2L(100吨/U，LMF (10 ，uM)lL， LMR (10mol/U 1L， LMP (10mol/L) 1L， 2 X Premix Ex Tq TM PCR (Probe qPCR) 12. 5L. RoxII O. 5L , ddH,O 7 .uL C.4 反应程序第一步:95 C 5 min; 第二步:95C 10日，60C 40日，40个循环。C.5 阳性对照、阴性对照和空白对照的设置阳性对照:大灰插揄;阴性对照:非大灰姑揄;空白对照:dd曰2() c C.6 结果判定C. 6. 1 质控标准C. 6. l. 1 阳性对照阳性对照Cl值应运35，并山现典型的扩增曲线OC. 6. l. 2 阴性对照空白对照、阴性对!照无Ct值且无扩增由线。C. 6. l. 3 有效原则如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。C. 6. 2 结果描述与判定待汩IJ样品的Ct值二40时，判定为非大灰据揄。待训样品的Cd白王三35时.步IJ定为大灰阳愉o1则样品的35Ct直40时，i但甲:新进行测试;如果甲新测试的Ct值二40时，判址:为非大灰括揄;如果重新测试的(丁伯40时，则判定为大灰归蛐。8 附录(资料性)大灰括蛐与近似种的鉴别D 大灰姑且由与近似种的鉴别见表D.l。大灰括蛐与近似种鉴别特征比较表D.l名种特征维罗纳虫!，H俞L.vf:rollensis Lcssona 已二，Polloncra .1882 杂色如由俞黄虫舌由俞康氏姑且俞大灰姑揄L. aeoLianus Giusti, 1973 L. ILavus Linnacus, 1758 L. conerneosi Bottgcr. 1882 L.ma:Limus Linnacus. 1758 较多元规则形状的棕色小斑点和短线较多元规则形状的黑色大斑点不口短线较多无规则形状的黑色小斑点零散的浅黄色小斑点零散的黑色小斑点斑点边缘淡红包.中间白色黄山淡黄色灰白色灰黄色腑足1/3体长17日1日，19mm 1/5体长1/1体长30%体长外套膜30 mm60 mm 15 mm18 mm 10 mm15 mm 10 mm 30 mm60 mm 尾岭忧Z时由U可llNON-意大利北部的特夭托省寻|自hnps:/images. app. goo. gl/ tmvUEUXinr9CgKYZ7 意大利南部的埃奥利群岛自h(ps:/i日1咔es.app. goo. gl几j.foNphAZfnSwXxG8地中海沿岸、欧洲、中国、智利和南非引向hnps: / /image吨.app. goo. gl厅T5FQxmmQfY5MPmz7希腊、保加利亚、阿尔巴尼亚自hllPS:/im咄es.app. goo. gl!Cp1ZCaECLdAjBcZDA 欧洲、非洲北部、高加索山脉引向hups:/ /images. app. goo. gl!ljuYybfs1dQMCrvr7 分布典型软体照片对比之二