Clustalx多序列比对-生物信息学.doc

实验三：多条序列比对——Clustalx

实习目的：了解掌握Clustalx软件的应用，学会做多条序列比对并分析。
实习内容：
一、ClustalX的使用
Clustal是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。即从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在进化树上的位置，由近及远的将其它序列依次加入到最终的比对结果。
1. 准备要比对的序列
请查找至少存在于5个物种中的同源序列（核酸或蛋白质皆可），并保存为fasta格式，存为文本文件（所有的序列请粘贴到同一个文本文件中）。选择NM、XM或NP打头的序列，不要选择NC或NW打头的序列，那是全基因组序列。
建议关键词：hemoglobin，trypsin, peroxidase, p53, Superoxide Dismutase, h5n1, etc.
2. 打开clustalX程序
开始菜单－程序－clustalX2- clustalX2
3. 载入序列
点最上方的File菜单，选择Load Sequence-选择你刚保存的序列文件，点打开。
在左侧窗口里是fasta格式序列的标识号，取自序列第一行“>”后的字符。注意：ClustalX程序无法识别汉字，无法识别带空位的文件夹名，如 my document。各位同学的序列文件不要保存在桌面上或带汉字的文件夹中，推荐保存在D盘根目录下。

4. 比对参数的选择
可以对两条序列比对的参数和多条序列比对的参数进行设置。
a. 两条序列比对的参数设置
点击Alilgnment菜单，选择Alignment Parameters,再选择Pairwise Alignment Parameters。首先可以选择比对的效果，是slow/accurate 还是fast/approximate。第一种模式采用的是动态规划算法进行比对的，第二种模式采用的是启发式的算法。除非序列非常长，一般采用第一种模式。可以选择空位罚分系统，要使用的DNA或蛋白质替换矩阵，也可以自己上传某个替换矩阵进行比对。
b. 多条序列比对参数设置
点击Alilgnment菜单，选择Alignment Parameters,再选择Multiple Alignment Parameters。
5. 更改输出格式
点击Alignment菜单，选择Output Format Options。
默认的是输出clustal format,如果需要其它格式，可在复选框里打勾。PHYLIP格式是利用PHYLIP软件进行建树时，需要输入的格式。

6. 进行比对
点击Aliglnment菜单，选择Do Complete Alignment.此时出现一个对话框，提示你比对结果保存的位置，你在上一步选择了多少种输出格式，这里就需要给出多少个文件的路径。选择好了点OK即可。
要得到理想的比对结果，你可能需要选择不同的参数，进行多次比对，最后再对各种比对结果进行分析，选择哪个是最合理的结果（the result making biological sense）。
比对结束后生成的aln文件是多条序列比对的结果，可以用记事本打开浏览。在某一列比对结果下方如果出现*，说明这列是完全匹配。dnd文件是比对过程中生成的进化树，可以用treeview打开浏览。
7. 迭代比对
如果序列比对结果不理想，可以采用迭代选项，多次迭代寻找最佳比对结果。
点击Alignment菜单，选择iteration,选择iterate each alignment step或iterate final alignment.
然后再点击Aliglnment菜单，选择Do Complete Alignment进行比对。
8. 概型（Profile）比对模式
以上介绍的都是Multiple alignment Mode，ClustalX还提供了一个概型比对模式，在菜单栏下方选择Profile Alignment Mode,可以对两个比对结果（alignment, termed profile here）进行再比对，或将一条序列与一个比对结果（profile）进行比对。
二、Treeview
Clustalx产生的guide tree(即后缀为dnd文件)，可以通过treeview软件浏览。
解压缩并安装treev32.rar文件。双击后缀为dnd文件，选择treeview程序打开即可。
作业：
1. Clustalx是多条序列比对软件，为什么需要设置两条序列比对的参数？
答：Clustal是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。即从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在进化树上的位置，由近及远的将其它序列依次加入到最终的比对结果，既是采用两两比较后再继续进行比较的方法，所以，需要设置两条序列比对的参数。
2. 利用entrez或srs搜索来自于不同物种的同源序列(othologs)，利用clustalX进行比对，给出所选序列简要信息（fasta格式第一行），比对所用的参数，比对过程中产生的guide tree（dnd文件）,并分析比对结果（序列之间相似度关系，保守位点所在位置等）。
答：简要信息：
>gi|23466358|gb|AF349413.3| Danio rerio estrogen receptor beta b mRNA, complete cds
>gi|145308317|gb|EF530592.1| Paramisgurnus dabryanus estrogen receptor beta mRNA, partial cds
>gi|32186925|gb|AY305027.1| Halichoeres tenuispinis estrogen receptor beta mRNA, complete cds
>gi|2073112|dbj|AB003356.1| Anguilla japonica mRNA for estrogen receptor, complete cds
>gi|89037528|ref|NW_925528.1| Homo sapiens chromosome 14 genomic contig, alternate assembly (based on Celera), whole genome shotgun sequence
>gi|30962102|emb|AJ314602.1| Candidia barbatus mRNA for putative estrogen receptor
>gi|61097789|dbj|AB190290.1| Rutilus rutilus ERb mRNA for estrogen receptor beta, complete cds
比对所用参数：

Guide tree:

比对结果见附表1：
附表1：
Candidia TATCACTATGGTGTCTGGTCATGTG---AGGGATGCAAGGCT---------TTTTTCAAA
Rutilus TATCACTATGGTGTCTGGTCATGTG---AGGGGTGCAAGGCT---------TTCTTCAAA
Danio TATCACTATGGTGTCTGGTCATGTG---AAGGGTGCAAGGCT---------TTCTTCAAG
Paramisgurnus TATCACTACGGGGTGTGGTCATGCG---AGGGGTGCAAGGCT---------TTCTTCAAA
Halichoeres TATCACTACGGTGTGTGGTCCTGCG---AGGGCTGTAAAGCA---------TTTTTCAAG
Anguilla TATCACTACGGGGTGTGGTCCTGCG---AAGGCTGCAAGGCC---------TTCTTCAAG
Homo TA-CACTGAGGGACTGAGCCTGGTGTATATGGCAGCAAGACTGGATGGTGGCTTTGCAGC
** **** ** * * * * * ** * ** * * * **

Candidia ------CGGAGCATTCAAGGACACAATGACT--ATATGTG----TCCAGCCACCAACC--
Rutilus ------CGGAGCATTCAAGGACACAATGACT--ATATTTG----TCCAGCCACCAACC--
Danio ------CGTAGCATTCAAGGTCACAATGACT--ATATTTG----TCCAGCCACCAACC--
Paramisgurnus ------CGAAGCATTCAAGGACACAATGACT--ACATTTG----TCCAGCCACCAACC--
Halichoeres ------AGGAGTATCCAAGGACACAACGACT--ACATCTG----CCCTGCAACAAATC--
Anguilla ------AGGAGCATCCAAGGGCACAATGGCT--ACATCTG----CCCCGCCACCAACC--
Homo AGTCTCCAGAGCATTCCATGAGATCCGGGCTCGAAATCCAGCATTTCAGCCACAAACTTT
** ** * * * * * ** * ** * ** ** **

Candidia AGTGCACCATTG-------ACAAGAGCCGACGCAAAAGCTG-CCAGGCCTGTCGACTCCG
Rutilus AGTGCACTATTG-------ACAAGAGCCGACGCAAGAGCTG-CCAGGCCTGTCGACTCCG
Danio AGTGCACTATTG-------ACAAGAGCAGACGCAAGAGCTG-TCAGGCCTGTCGACTCCG
Paramisgurnus AGTGCACCATCG-------ACAAGAGTCGTCGTAAGAGCTG-TCAGGCCTGTCGATTCCG
Halichoeres AATGCACTATCG-------ACAAGAACCGGCGTAAGAGCTG-CCAAGCCTGCCGCCTACG
Anguilla AGTGCACCATCG-------ACAAGAACCGGCGCAAGAGCTG-CCAGGCCTGCCGACTCCG
Homo GATGGACTTTGGCTCAGGTACTGGTTCTGTCACCTGGGCTGCTCACAGTATTTGGGGCCA
** ** * * ** * * * **** ** * *

Candidia CAAGTGCTATGAA---ATGGGCATGATGAAGTGTGGTGTGAGGCGGG----AACGCTGCA
Rutilus CAAGTGCTATGAA---ACAGGCATGATGAAGTGTGGTGTGAGGCGGG----AACGCTGCA
Danio CAAGTGCTATGAA---GTGGACATGATGAAGTGTGGTGTGAGGAGGG----AGCGCTGCA
Paramisgurnus CAAGTGCTATGAA---GTGGGCATGATGAAGTGTGGTGTGAGGCGAG----AACGGTGCA
Halichoeres TAAATGCTACGAA---GTGGGCATGATGAAATGTGGTGTAAGACGTG----AACGCTGCA
Anguilla CAAGTGCTACGAA---GTGGGCATGATGAAGTGTGGTGTGAGACGGG----AGCGTTGTA
Homo GAGCCTACGTGAATATATGTGTGTGGACAGATCAGCTGCCATGTTGGTTTTGGCAGAAAA
* *** ** * * * ** * * * *

Candidia GTTACCGTGGTGCTCGTCATCGTCGCAAC---CCCCAGATCAGGGACAGCTCGGGCGGGG
Rutilus GTTACCGCGGTGCTCGTCATCGTCGAAAT---CCCCCGATCAGAGACGGCTTGGGCGAGG
Danio GTTATCGAGGTGCTCGACATCGTCGTAAC---CCCCAAATCAGAGACAGCTCTGGCGGGG
Paramisgurnus GTTACCGCGGTGCCCGTCATCGTCGCCAT---CCCCAGACGAGAGACGGCTCAGGCAAAG
Halichoeres GCTATCGAGGAACCCGACACCGCCGTGGTGGACTCCAGCCTCGGGATCCCACAGGCAGGG
Anguilla CCTACCGGGGGGCGCGACACCGCCGCATG---CCCCACATCCGCGAGTTGGCGGGCACAG
Homo ACTACTGAAAGGTGGTTCAGAATCTGGGGAG-CCTTATATTCCAGGTGTCTTTTTCAGAC
** * ** * * * *
Candidia CTTTAG---------GGGTCAGAG-GTTGTTCCCAGCATCATTTAGAAATTCCT--CTCA
Rutilus TGTTAG---------GGGTCAGAG-GTTGTTCCCAGCATAATTTAGAAATTCCT--CTCA
Danio TGGTAG---------GACTCAGAG-GTCAATCCCAGCAGCATCTAGAGTTCCCC--CTCA
Paramisgurnus CATTAG---------GGGTCAGAG-GTCGCTCCCAGCATAATCTAGAATTTCCG--TTCA
Halichoeres GTTTGGTCAGAGTGGGGCTTGGTT-CTCGAGCCCAAAGGCATCTCCACCTTGAGGGTCCC
Anguilla ---------------GGGGCGGGG-CCAGGACCCAGAGGCGGGGCGAGGG---------A
Homo AGTTTCTACCTGTATCACCCAAGGTGCAGTTTGATGTAGTAGTGTCAGCTTTTTC-CTTA
*

Candidia ATCCCACTCATCACCTCTTCCCTTCAGGGGGCAG--AGCTGAGGGGTGTGGCC-----TG
Rutilus ATCCCACTGATCACCTCTTCCCTTCTGGGGGCAG--AGCTGAGGGGTGTGTCC-----TG
Danio GTCCCTCTCAGCACCTCTTTCCTTCAGGGGGCAG--AGCTGAGGGACGGGGCC-----TG
Paramisgurnus TCTCCCCTCATCAACTCGTCCCTTCGGGTGGCGC--ATCCGAGGGCCGTGGCC-----TG
Halichoeres CTCACCCCTGTCACCCCCCTCCCTCAGATGAGCC--ACGTACACCACGCAGCCA----TG
Anguilla GTC---------------GTCCCTCAGACGCAGG--AGGCGCAGTCCTCGGCGC----TC
Homo AGTGAACTGCCCAGCAAGGCTGACCGCACTGAGGTAGTTCAAACCTTATGGCGTAAGACA
* *

Candidia AGCTTCTCCCCTGAGCAGTTGGTGAACTGCATTCTGG--AGGCAGAGCCTCCTCAGATTT
Rutilus AGCTTCTCCCCTGAGCAGTTGGTGAACTGTATTCTGG--AGGCGGAGCCTCCTCAGATTT
Danio AACTATTCCCCTGAACAATTGGTCAGCTGTATTCTAG--AGGCGGAGCCACCTCAAATTT
Paramisgurnus ------TCCGCTGAGCAGCTGGTGAACTGTATTCTAG--AGGCGGAGCCTCCTCAGATTT
Halichoeres AG------CCCAGAGGAATTCATCATGCGCATCATGG--AAGCAGAGCCACCAGAGATCT
Anguilla A------CGCCGGAGCAGTTAATCAACCGCATCATCG--AGGCGGAGCCGCCGGAGATCT
Homo GGTCATTTCCTGGTACTGGTGGAGAATGGAACAAAAGCTGGGCACAGCCTTCTCATGGAT
* * * * * * ** **** * * *

Candidia GCCTGAGA----------GAGCCAGTGAAGAAGCCATACACGGAGGC-CAGCATGATGAT
Rutilus GCCTGAAA----------GAGCCAGTGAAAAAGCCGTACACTGAGGC-CAGCATGATGAT
Danio ACCTGAGA----------GAGCCGGTGAAAAAGCCATACACTGAGGC-TAGCATGATGAT
Paramisgurnus ACCTGAAA----------GAGCAGGTGCAGAAGCCGTACACTGAGGC-CAGCATGATGAT
Halichoeres ACCTCATG----------GAGGAGCAGAAGAAGCCTTTTACCGAGGC-CAGCATGATGAT
Anguilla ACCTCATG----------AAGGAGCTGAAGAAGCCCTTCACCGAGGA-CAGCATGATGAT
Homo GCCAGGGATCTGGTCCTTAAGGGAAAAGAGAAGTCACCTTTGGACCCTCGACCTGGTTTT
** ** * *** * ** * ** * *

Candidia GTCACTCACCAGCCTTGCTGACAAGGAACTGGTGCTCA--TGATCAGCTGGGCCAAGAAG
Rutilus GTCACTAACCACCCTCGCTGACAAGGAACTGGTGCTCA--TGATCAGCTGGGCCAAGAAG
Danio GTCACTAACAAGCCTCGCCGACAAGGAGCTGGTGCTCA--TGATTAGCTGGGCGAAGAAG
Paramisgurnus GTCACTAACCAACCTTGCTGACAGGGAACTGGTGCTCA--TGATCAGCTGGGCTAAAAAA
Halichoeres GTCCCTCACAAACCTGGCAGACAAGGAGCTGGTGCTTA--TGATCAGCTGGGCTAAAAAG
Anguilla GTCACTCACCAACCTGGCCGACAAGGAGCTCGTCCTCA--TGATCAGCTGGGCCAAAAAG
Homo GTCTTTGCCCCGTGTCCCCATGAACTCCCTTGTCCCCAGTTGACCAACCTGGCCTGTAGC
*** * * * * * ** ** * * *** * * *** *
Candidia ATACCA-GGTTTTGTGGAGCTGACACTTTCAGATCAGGTGCATCTATTGGAATGCTGCTG
Rutilus ATACCA-GGTTTCGTGGAGCTGACGCTTTCAGATCAGGTGCATCTATTGGAATGCTGCTG
Danio ATACCA-GGTTTTGTAGAGTTGACTTTGTCAGATCAGGTGCATTTGCTGGAATGCTGCTG
Paramisgurnus ATACCA-GGTTTTGTGGAGCTGTGTTTGTCTGATCAGGTGCATCTGTTGGAATGCTGTTG
Halichoeres ATCCCT-GGCTTTGTCGAGCTGTGTCTAGCTGATCAGATTCACCTCCTAAAGTGCTGCTG
Anguilla ATCCCT-GGGTTTGTGGAGCTGGACCTGTCTGACCAAGTACACCTGCTGGAGTGCTGTTG
Homo TTCTCACAGGCGTACCATCCCATCCCCTTCAGCTGGAACA-AGAAACCAAAGGAAGAAAA
* * * * * * *

Candidia GCTGGATATTCTGATGTTGGGATTGATGTGGAGATCTGTGGATCATCCTGGGAAACTCAT
Rutilus GCTGGATATTCTGATGTTGGGATTGATGTGGAGATCTGTGGATCATCCCGGGAAACTCAT
Danio GCTGGATATTCTGATGTTAGGATTGATGTGGAGATCTGTGGATCATCCTGGGAAACTCAT
Paramisgurnus GCTGGATATTCTGATGTTGGGACTGATGTGGAGATCCGTAGATCATCCTGGGAAACTCAT
Halichoeres GTTGGAAATTCTGATGCTGGGCCTGATGTGGAGGTCTGTGGATCATCCTGGGAAACTAAT
Anguilla GCTGGAGGTGCTGATGCTGGGCCTGATGTGGAGGTCTGTGGATCACCCTGGGAAACTCAT
Homo GTTCTCTATGGTGATCCTTGCTCGGGGGTCTCCAGAGGAGGCTCATCGCTGGCCCCGTAT
* * * **** * * * ** * * *** * ** * **

Candidia CTTCTCACCTGACCTCAAACTGAACAGGGATGAGTGGAATTGTGT-TGAAGGCATCATGG
Rutilus CTTCTCACCCGACCTCAAACTGAACAGGGGTGAATGGAATTGTGT-TGAAGGCATCATGG
Danio CTTCACCCCTGACCTCAAGCTCAACAGGGAGGAAGGGAATTGTGT-TGAAGGCATCATGG
Paramisgurnus CTTCTCACCAGACCTCAAGCTCAACCGGGACGAATGGGGTTGTGT-TGAAGGCATCATGG
Halichoeres CTTCTCTCCTGACTTCAAACTCAACAGAGAGGAGGGTCAGTGTGT-GGAGGGCATCATGG
Anguilla CTTTTCCCCAGACCTCAAGCTCAACAGGGATGAGGGAAGTTGTGT-GGAGGGGATCCTGG
Homo CACTCAGCCTGTCCTTAAACGGCCTCGCCATGTGCATTGTCACTTGTGCTGTCCAGATGG
* ** * * * ** * * * * * * ***

Candidia AGATCTTTGACATGCTGCTGGCCACGACCTCCAGATTCAG--AGAATTGAAGCTACAGAG
Rutilus AGATCTTTGACATGCTGCTGGCCACCACCTCCAGATTCAG--AGAACTGAAGCTACAGAG
Danio AGATTTTTGACATGCTGCTGGCCACCACCTCTCGATTCAG--AGAGCTGAAGCTGCAGAG
Paramisgurnus AGATCTTTGACATGCTGCTGGCCACCACCTCTAGATTCAG--AGAACTGAAGCTACGGAG
Halichoeres AGATCTTTGACATGCTGCTGGCTGCCACCTCTCGGTTTCG--TGAGCTGAAGCTTCAGAG
Anguilla AAATCTTCGACATGGTGCTGGCGGCAACCTCCAGGTTTCG--GGAGCTGAAGCTACAGAG
Homo GCACATGCAGCATGCTG-TGCTCACAGCCCGCCGGCACGGCAGGGATTTGTATCGTTGTG
* * **** ** ** * ** * * * * * *

Candidia GGAGGAATACGTCTGTCTCAAAGCCATGATCCTTCTCAACTCCAATAACTGTTCAAGCTT
Rutilus GGAGGAATACGTCTGTCTCAAAGCCATGATCCTTCTCAACTCCAATAACTGTTCAAGCTT
Danio AGAGGAATACGTCTGTCTCAAAGCCATGATCCTGCTCAACTCTAATAACTGTTCGAGTTT
Paramisgurnus AGAGGAATATGTCTGCCTCAAAGCCATGATCCTCCTCAACCC------------------
Halichoeres GGAGGAGTACGTCTGTCTGAAGGCCATGATCCTCCTCAACTCCAATCTGTGTTCGAGCTC
Anguilla GGAGGAGTATGTGTGCCTCAAAGCCATTATCCTCCTCAACCCCAACCTGTGCACAACGTC
Homo CCCGTGTCAGCTCCTGGGGAGATCTTTTACCTGTGCTTACTCCG-TCTGCGTTTCCTCCA
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