膀胱尿路上皮细胞癌坏死性凋亡相关长链非编码RNA预后模型的构建.pdf

收稿日期：2023-02-13基金项目：广东省自然科学基金（2020A1515010135）作者简介：陈加洪，硕士，住院医师；黄泓元，共同第一作者；李建宏，通信作者，研究员，E-mail：汕头大学医学院学报Journal of Shantou University Medical College第36卷 第3期2023年9月Vol.36 No.3September 2023膀胱尿路上皮细胞癌坏死性凋亡相关长链非编码RNA预后模型的构建陈加洪，黄泓元，李建宏（汕头大学医学院第二附属医院小儿外科，广东汕头515041）摘要 目的：构建坏死性凋亡相关长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的膀胱尿路上皮细胞癌（urothelialcarcinoma of bladder，BLCA）预后模型。方法：从TCGA数据库获取431例BLCA患者的转录组数据和临床数据，并将其按11分为训练组和验证组，结合来自公共数据库的67个坏死性凋亡相关基因，使用R软件进行数据处理和分析，通过Pearson相关性分析、Cox回归分析、LASSO回归模型构建坏死性凋亡相关lncRNA预后模型，运用Kaplan-Meier法进行生存分析，使用接受者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析评估模型的预测性能，并且进行了免疫微环境分析。结果：成功构建了基于5个坏死性凋亡相关lncRNA的BLCA预后风险模型。生存曲线显示，高风险组的总生存期低于低风险组（P0.05）。多因素Cox回归分析显示该模型的风险评分可作为BLCA患者总生存期的独立预后因子（P0.001）。风险评分预测1年、3年和5年生存率的ROC曲线下面积分别为0.685、0.662和0.664。训练组和验证组的结果相互验证了该模型的有效性。肿瘤微环境中，高风险组相对于低风险组具有更明显的免疫浸润状态。结论：成功构建了坏死性凋亡相关lncRNA的BLCA预后模型，该模型可在一定程度上预测BLCA患者的生存率。关键词 膀胱尿路上皮细胞癌；坏死性凋亡；长链非编码RNA；预后中图分类号 R737.14文献标志码 A文章编号 1007-4716(2023)03-0135-06DOI：10.13401/ki.jsumc.2023.03.002Prognostic modeling of necroptosis-associated long noncoding RNA inurothelial carcinoma of bladderCHEN Jiahong,HUANG Hongyuan,LI Jianhong(Department of Pediatric Surgery,the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China)Abstract Objective:To construct a necroptosis-associated long noncoding RNA(lncRNA)prognostic model forurothelial carcinoma of bladder(BLCA).Methods:Transcriptome data and clinical data of 431 BLCA patientswere obtained from the TCGA database and divided into training and validation groups on a 1:1 basis,combinedwith 67 necroptosis-associated genes from public databases,and data were processed and analyzed using the Rsoftware.The necroptosis-associated lncRNA prognostic model was constructed by Pearson correlation analysis,Cox regression analysis,and LASSO regression model.Survival analysis was performed using the Kaplan-Meiermethod.The predictive performance of the model was assessed using receiver operator characteristic(ROC)curveanalysis,and an immune microenvironment analysis was performed.Results:A prognostic model of BLCA basedon five necroptosis-associated lncRNAs was successfully constructed.Survival curves showed that the overallsurvival of the high-risk group was lower than that of the low-risk group(P0.05).Multifactorial Cox regressionanalysis showed that the risk score of this model could be used as an independent prognostic factor for overallsurvival of BLCA patients(P0.4 且 P1和错误发现率0.05。1.3坏死性凋亡相关lncRNA预后风险模型构建将样本按11随机分为训练组和验证组，并进行单因素Cox回归分析，设定P0.001为过滤筛选条件，进一步提取差异表达的lncRNA后，用R语言glmnet包进行LASSO回归分析，风险评分=k=1ncoef()lncRNAkexpr()lncRNAk。其 中 n、coef、expr分别代表模型lncRNA、lncRNA的表达系数和表达量。同时，以风险评分的中值作为分界点，将BLAC患者分为高风险组和低风险组。1.4BLCA坏死性凋亡模型生存分析使用Kaplan-Meie法对高风险组和低风险组进行生存分析，并绘制生存曲线图，以及各分组的风险曲线、生存状态图。1.5BLCA坏死性凋亡相关lncRNA的独立预后分析使用R软件包survival对样本进行单因素Cox及多因素 Cox 独立预后分析，判定条件为 P0.05，同时绘制森林图。1.6BLCA坏死性凋亡相关lncRNA预后模型对预测生存率的性能评估使用R软件包survminer和timeROC，对模型进行1、3和5年生存率和接受者操作特征（receiveroperator characteristic，ROC）曲线分析，同时计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。1.7BLCA坏死性凋亡相关lncRNA临床分组模型构建验证使用R软件包survival和survminer将样本数据根据临床分期分组后，进行生存分析并绘制生存曲线（P0.001）。1.8肿瘤免疫微环境、免疫细胞浸润和功能分析使用R软件包limma、estimate对高低风险组肿瘤免疫微环境进行评分并分析不同细胞的评分差异，使用R软件包limma、ggpubr、reshape2对高低风险组免疫功能和免疫细胞浸润评分进行差异分析。2结果2.1BLCA患者坏死性凋亡相关lncRNA的筛选和鉴定从 TCGA 数据库获取了 431 例 BLCA 患者样本，并将其中生存时间缺失或30 d的样本排除在后续分析之外。结合来自公共数据库的67个坏死性凋亡相关基因，最终使用Pearson相关分析鉴定了1 265个坏死性凋亡相关lncRNA。通过差异分析，筛选出在正常组织和肿瘤组织中差异表达的827个坏死性凋亡相关lncRNA，其中在肿瘤组织中715个上调，112个下调。137陈加洪，等膀胱尿路上皮细胞癌坏死性凋亡相关长链非编码RNA预后模型的构建第 3 期2.2坏死性凋亡相关lncRNA预后模型的建立和验证通过单因素Cox回归分析，进一步筛选出了17个与 BLCA 预后相关的坏死性凋亡相关 lncRNA（图 1）。接下来，为防止模型过度拟合，进行LASSO回归分析。当lg 的一级值为最小偏差可能性时，提取了 8 个与 BLCA 坏死性凋亡相关的lncRNA。最后，采用多因素 Cox 回归分析筛选出 5 个最佳的差异表达 lncRNA（OPA1-AS1、AC021321.1、AC004076.2、MIR4435-2HG、AL353622.1），用以构建BLCA预后风险模型。根据每个lncRNA的表达水平和多因素Cox回归分析得到的相关系数计算患者的风险评分，以风险评分的中位数为阈值，将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存曲线显示，训练组、验证组和成套组中、高、低风险组的总生存期（overall survival，OS）差异有统计学意义（P0.05），且高风险组的生存率明显低于低风险组（图2）。根据以上5个lncRNA预后标志物，BLCA患者样本的风险评分排名分布如图3A3C所示。训练组、验证组和成套组的散点图（图 3D3F）显示，BLCA患者的生存状态与风险评分相关，随着风险评分的增加，患者的死亡率升高。单因素和多因素Cox回归分析显示，年龄、肿瘤分期和风险评分均为BLCA患者OS的独立预后因素（图4）。ROC曲线显示，风险评分的AUC为0.685，与年龄、性别、肿瘤分期相比其面积更大（图5A）。风险评分预测 1 年、3 年和 5 年生存率的AUC值分别为0.685、0.662和0.664（图5B）。2.3肿瘤免疫微环境特征分析在肿瘤免疫微环境评分中，高风险组的基质细胞评分（P=1.410-13）、免疫细胞评分（P=5.610-12）和肿瘤微环境综合评分（P=1.310-14）均高于低风险组（图6）。高风险组和低风险组的免疫细胞和免疫功能的基因集富集分析表明高风险组比低风险组具有更明显的免疫浸润状态（图7）。A：17个坏死性凋亡相关lncRNA差异表达的森林图；B：17个坏死性凋亡相关lncRNA差异表达的热图。图1坏死性凋亡相关lncRNA的单因素Cox回归分析A：训练组预后生存曲线；B：验证组预后生存曲线；C：成套组预后生存曲线。图2高风险组和低风险组BLCA患者生存曲线138汕头大学医学院学报第36卷3讨论BLCA作为最常见的泌尿系统恶性肿瘤，全世界每年约有 43 万新发病例和 16.5 万死亡病例1。研究表明，表达失调的lncRNA广泛参与了BLCA细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和抗肿瘤耐药性等多种肿瘤发病机制9。坏死性肿瘤细胞模拟纳米疫苗可以通过诱导NKG2D+自然杀伤细胞和CD8+T细胞的扩增来增强抗肿瘤免疫10。相反地，肿瘤细胞通过CXCL1和Mincle产生免疫抑制性肿瘤微环境，可促进恶性肿瘤的发生11。这些研究结果提示lncRNA可能可以作为BLCA诊断和预后的潜在生物标志物和免疫治疗新靶点。本研究从预后模型和肿瘤免疫微环境分析等方面探讨坏死性凋亡相关 lncRNA 与 BLCA 的关系，为进一步研究AC：分别为训练组、验证组、成套组的风险评分分布；DF：分别为训练组、验证组、成套组的生存状态散点图。图3坏死性凋亡相关lncRNA风险评分分析A：单因素Cox独立预后分析森林图；B：多因素Cox独立预后分析森林图。图4风险评分和临床特征的独立预后分析A：风险评分和临床特征的ROC曲线；B：风险评分预测1年、3年和5年生存期的ROC曲线。图5坏死性凋亡相关lncRNA预后风险评分性能分析139陈加洪，等膀胱尿路上皮细胞癌坏死性凋亡相关长链非编码RNA预后模型的构建第 3 期BLCA患者预后情况及临床个体化治疗提供参考。已有研究建立了由12个细胞凋亡相关lncRNA模型12和 5 个与免疫相关 lncRNA 构成的风险模型13，以评估BLCA患者的预后风险并为临床治疗提供信息。在本研究筛选出最佳的5个坏死性凋亡 相 关 lncRNA（OPA1-AS1、AC021321.1、AC004076.2、MIR4435-2HG、AL353622.1）并构建了预后风险模型。有研究表明，MIR4435-2HG在外周血或血清中的高表达具有预测9种肿瘤风险的价值14。本研究中，训练组、验证组和成套组的生存曲线集、风险评分图、生存状态图均表明构建的预后模型具有良好的预测价值，高风险组的OS明显低于低风险组，这表明坏死性凋亡可作为促癌因素影响 BLCA 患者的生存及预后情况，与以往研究结果一致15。坏死性凋亡可通过多种机制促进肿瘤进展，包括诱导内皮细胞程序性坏死，从而促进肿瘤细胞外渗和转移及诱导的CXCL1和Mincle信号的平行网络，促进巨噬细胞诱导的适应性免疫抑制16。该预后模型的风险评分可作为独立预后因素，风险评分预测1年、3年和5年生存期的ROC曲线表明此模型有良好的预测性能，在BLCA中的作用机制值得进一步探索。免疫细胞对肿瘤微环境起关键作用。本研究通过使用单样本基因集富集分析评分，发现高风险组具有更明显的免疫细胞浸润状态，尤其是高风险组中B细胞、Treg细胞的评分都比低风险组高。B细胞被认为是体液免疫的主要效应细胞，通过分泌免疫球蛋白、促进T细胞反应、杀死癌细胞、抑制肿瘤进展17。有研究表明Treg细胞与癌细胞协同工作，产生具有生物活性的转化生长因子-，并创造一个免疫抑制的微环境，诱导肿瘤的免疫逃逸18。B细胞在触发有效的抗肿瘤免疫反应方面起积极作用，而 Treg 细胞则起消极作用。这表明，坏死相关lncRNA在肿瘤微环境的免疫调节中可能是双向的、复杂的，需要进一步分析以确认它们在免疫调节中的作用。总之，肿瘤微环境及其免疫细胞浸润在揭示BLCA患者预后风险方面起着重要作用，进一步的探索将有助于A：免疫相关功能评分；B：免疫细胞浸润评分。图7高、低风险组免疫功能和免疫细胞浸润评分差异分析A：基质细胞评分箱线图；B：免疫细胞评分箱线图；C：肿瘤微环境综合评分箱线图。图6高、低风险组肿瘤微环境评分箱线图140汕头大学医学院学报第36卷BLCA患者的预后预测及免疫治疗。本研究有以下局限性。首先，作为一项回顾性研究，它容易受到自身固有偏见的影响。其次，预后模型基于TCGA公共数据库，缺乏其他数据库样本的验证。第三，本研究证实预后模型具有良好的预测价值，但仍需要进一步的体外基础实验来探索坏死性凋亡相关lncRNA在BLCA中的作用机制。第四，肿瘤样本与正常样本的比例不平衡，这可能会影响功能富集分析的精度。最后，BLCA 患者预后特征与靶向治疗和免疫治疗效果之间的关系有待通过大量的临床试验进行研究。综上所述，本研究构建了BLCA坏死性凋亡相关的lncRNA预后模型，该模型有良好的预测性能，可为 BLCA 患者的个体化和精准治疗提供参考。参考文献1TRAN L,XIAO J F,AGARWAL N,et al.Advances inbladder cancer biology and therapyJ.Nat Rev Cancer,2021,21(2):104-121.2ANTONI S,FERLAY J,SOERJOMATARAM I,et al.Bladdercancerincidenceandmortality:aglobaloverview and recent trendsJ.Eur Urol,2017,71(1):96-108.3GAO W T,WANG X Y,ZHOU Y,et al.Autophagy,ferroptosis,pyroptosis,andnecroptosisintumorimmunotherapyJ.Signal Transduct Target Ther,2022,7(1):196.4HAN Q R,MA Y,WANG H,et al.Resibufogeninsuppresses 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