高效液相流动相缓冲盐选择.docx

下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：
一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1） 酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。
（2） 碱性化合物，在高pH条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱柱不利。通常许多碱性化合物在低pH条件的保留就已经满足要求了，所以可选择低pH条件。如果选择高pH条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱。
水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变pH值、改善峰形、提高分离度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时，低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析方法时流动相可首选0.1%的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右（根据实际情况，有时可以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超过50mM）。

下表是Waters提供的一个资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系。
缓冲盐/流动相改性剂
pKa
缓冲范围
挥发性？(±1 pH)
是否MS兼容？
备注
TFA
0.3
-
是
是
离子对试剂，能够抑制MS信号，通常使用的浓度范围0.02~0.1%
乙酸
4.76
-
是
是
同乙酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.1~1.0%
甲酸
3.75
-
是
是
同甲酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.1~1.0%
乙酸盐（铵盐）
4.76
3.76~5.76
是
是
通常使用1~10mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的
甲酸盐（铵盐）
3.75
2.75~4.75
是
是
通常使用1~10mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的
磷酸盐1
2.15
1.15~3.15
否
否
传统的低pH缓冲体系，UV透光度很好
磷酸盐2
7.2
6.2~8.2
否
否
当pH超过7时，降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命
磷酸盐3
12.3
11.3~13.3
否
否
当pH超过8时，降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命
4-甲基吗啡啉
~8.4
7.4~9.4
是
是
通常使用浓度为10mM或更少
氨水
碳酸氢铵
9.2
10.3(HCO3-)
9.2(NH4+)
8.2~10.2
8.2~11.3
是
是
通常使用浓度为5~10mM（用于MS工作时保持离子源温度超过150℃）。用氨水或乙酸调节pH值，在pH10时具有很好的缓冲能力。
乙酸铵
9.2
8.2~10.2
是
是
通常使用浓度为1~10mM
甲酸铵
9.2
8.2~10.2
是
是
通常使用浓度为1~10mM
硼酸
9.2
8.2~10.2
否
否
降低温度，减少浓度并使用色谱柱来延长柱寿命
CAPSO（3-环己胺基-2-羟基丙磺酸
9.7
8.7~10.7
否
否
两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为1~10mM，气味小
Glycine甘氨酸
2.4,9.8
8.8~10.8
否
否
两性离子缓冲液，比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些
1-甲基哌啶
10.2
9.3~11.3
是
是
通常使用浓度为1~10mM
CAPS
10.4
9.5~11.5
否
否
两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为1~10mM，气味小
三乙胺（乙酸盐）
10.7
9.7~11.7
是
是
通常使用浓度为0.1~1.0%。当使用乙酸滴定时形成可挥发性的缓冲液（不可用盐酸或磷酸）。作为离子对试剂用于pH7~9条件下的DNA分析
吡咯烷
11.3
10.3~12.3
是
是
温和的高pH缓冲液体现，柱寿命较长