重组基因导入受体细胞2.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,二、依赖于重组子结构特征分析筛选,(,一,),快速裂解菌落鉴定分子大小,主要是根据有外源,DNA,片段插入载体后的重组,DNA,与载体,DNA,之间的大小差异来鉴定重组子。,分别提取不同转化子的,DNA,，经琼脂糖凝胶电泳，由于重组,DNA,是载体,DNA,中插入了外源,DNA,片段，其分子量大于载体,DNA,分子，在琼脂糖凝胶板上出现的,DNA,带中，落后的带是重组,DNA,的带。,这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，直观快捷，只须获得质粒,DNA,分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。,此方法只用于重组子的初步鉴定。,(,二,),限制性内切核酸酶消化,载体被外源片段插入后，其限制性酶切割产物会发生变化，可根据电泳结果来判断外源基因是否插入了载体及其插入方向。,通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子，因为重组质粒,DNA,分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源,DNA,片段连接重组。,采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，且能判断外源,DNA,片段的插入方向及分子质量大小等。,基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒,DNA,，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。,完全酶切,简单操作过程是，用一种或两种能将外源,DNA,片段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒,DNA,，凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质粒多出一条泳带，据此将重组子和非重组子分离开来。如果插入片段与载体质粒大小相近，则最好用合适的酶将之线性化，通过比较大小确定其是否为重组分子。进一步利用在外源,DNA,片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向等。,部分酶切,通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒,DNA,分子进行部分酶解分析，根据部分酶解产生的限制性片段大小，确定限制性核酸内切酶识别位点的准确位置及各个片段的准确排列方式，从而将期望重组子筛选出来。,部分酶解法较全酶解法简单易行，两者通常用于当载体和外源,DNA,片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应,(,如只有酶切后的载体或只有外源,DNA,片段,),都明显多时的重组筛选。,三、核酸分子杂交分析,(,一,),分子探针,分子探针,是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的,DNA,分子、,RNA,分子或蛋白质分子。,分子杂交,核酸杂交：两种不同来源单链,DNA,或,RNA,相互配对的过程。,分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。,理想的探针标记物应满足的条件：,1),标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特异性、杂交稳定性及酶反应待征等；,2),检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；,3),操作简便、省时经济实用：,4),化学稳定性高、易于长期保存；,5),安全、无环境污染。,常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类。,1.,放射性标记物,放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有,32,P,、,3,H,、,35,S,、,14,C,、,125,I,等，其中以,32,P,、,3,H,、,35,S,最为常用。,32,P,标记的核苷酸具由高放射性，放射自显影检测灵敏度高，但其分辨力低，半衰期短,(14.3d),，探针不能长期保存。,与,32,P,标记物相比，,35,S,的放射性较弱，检测灵敏度低，但其分辨力高，放射自显影的本底低，适于细胞原位杂交等。半衰期较长,(87.1d),，辐射危害较小，使用较为方便安全。,3,H,主要用于制备高分辨力的原位杂交探针，因其释放的放射能很低，放射自显影的本底也不高但却需较长的曝光时间。半衰期长,(12.35a),，标记探针可较长时间保存。,标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。,2.,非放射性标记物,非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。,目前已广泛应用的非放射性标记物有生物素,(biotin),标记的核苷酸、地高辛,(digoxigenin),标记的核苷酸和荧光素,(fluorescein),标记的核苷酸等。此外，乙酰基氨基芴,(AAF),或乙酰基氨基碘芴,(AAIF,）、汞离子、金颗粒、银颗粒及磺基等标记的核苷酸也能作为标记物使用。,3.,探针标记方法,探针的标记有体内标记及体外标记两种方法。,体内标记法是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入,3,H-,胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞,DNA,分子上。,体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。,体外标记,包括化学法和酶法两种。,化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因,(,如磷酸基团,),发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备非放射性标记物的探针。,常用的化学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和交叉相连法等。,酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针。,常用的酶法有,DNA,缺口平移标记法、,DNA,随机引物标记法、,DNA,末端标记法及,PCR,标记法等。,(1),切口平移标记法,DNA,聚合酶,该法标记模板链,(2),随机引物标记法,Klenow,片段催化,该法标记模板互补链,随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物,。,随机引物：,4,6,使用随机引物标记的探针一般长,400-600,个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。,(,二,),核酸探针杂交分析,基本原理是：具有一定同源性的两条核酸,(DNA,或,RNA),单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。,该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段,(,称为探针,),。,核酸分子杂交技术：,具一定同源性的两条,(DNA,或,RNA),单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成,双链,。,探针,(,已知核酸片断，单链,),待测核苷酸序列,(,单链,),Blot:,是将待测生物大分子结合到一定的固相支持物上的方法。,(,这些结合在固相支持物上的生物分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。,),固相支持物,与,有效的转移方法,是此技术的成败关键。,基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜,(,或尼龙膜,),上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异,DNA,片段所在的位置。,根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、,Southern,印迹杂交和,Nothern,印迹杂交四类。,核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组,DNA,的最通用方法,杂交方法 适用范围菌落印迹杂交 检测细菌体固定在膜上后，经裂解释放的,DNA,斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的，固定在膜上的,DNA,或,RNA,原位杂交 直接检测细胞或组织中的,DNA,或,RNASouthern,印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的，已转移到膜上的,DNA Northern,印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的，已转移到膜上的,RNA,(1)Southern,印迹杂交,Southern blot DNA,杂交由,E.Southern,于,1975,年提出。,DNA,琼脂糖凝胶电泳 转移到,NC,膜上,DNA,或,RNA,探针杂交 放射自显影显杂交带,Southern,印迹杂交，有时又称为,DNA,印迹杂交或,Southern,DNA,印迹杂交等。,它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的,DNA,片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链,DNA,或,RNA,探针的杂交作用以检测这些被转移的,DNA,片段。,其基本原理是将待检测的,DNA,样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相,DNA,的位置上显示出杂交信号。通过,Southern,杂交可以判断被检测的,DNA,样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。,该项技术广泛被应用在遗传病检测、,DNA,指纹分析和,PCR,产物判断等研究中。,（,a,）,（,b,）,（,c,）,（,d,）,（,e,）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,Southern,杂交,纪念发明者,Edward Southern,（,1,）提取总,DNA,（,2,）酶解,（,3,）电泳,（,4,）转移到滤膜,（,5,）变性解链,（,6,）,DNA,探针及杂交,（,7,）洗脱,（,8,）放射自显影,（,9,）比较分析,Southern DNA,印迹杂交之,X,光显像图片,水稻（,Oryza sativa L,.),的叶绿体,DNA,分别用核酸内切限制酶,Bgl(A-C),、,BamH,（,D-F,）、,EcoR,（,G-I,）、和,Hind,（,J-L,）消化，加样在含有,EtBr,染料的,1%,的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同,32P,标记的玉米,psbA,探针作,Southern,杂交。,X,光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的,psbA,基因序列,在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它也存在一些不足之处：,第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合,DNA,的，这种结合并不十分牢固。,第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎,(,待别是经烘烤后,),。,第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合,DNA,效果不佳，不适宜于电转印迹法。,第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的,DNA,片段,(,特别是小于,200bp,的,DNA,片段,),结合能力不强。,硝酸纤维素滤膜,尼龙膜,现在人们更倾向于使用尼龙膜。,尼龙膜结合,DNA,和,RNA,的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合，经烘烤或紫外线照射后，这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂文。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高，这可通过增加预杂交液中的非待异性封闭试剂用量的方法加以克服。,(2)Northern,印迹杂交,Northern,印迹杂交是指将,RNA,分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法又称为,Northern RNA,印迹杂交等。,该法是在,Southern,印迹杂交基础上发展起来的，主要针对,RNA,分子的检测，基本步骤与,Southern,印迹杂交相似。但,RNA,分子与,DNA,分子有所不同，一般不能采用碱变性处理。,Northern,杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中某一特异,mRNA,的表达丰度，根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。这一技术应用十分广泛，常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研究。,注意：需在变性条件下电泳，防止,RNA,形成二级结构。,在,RNA,变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。,(3),斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总,DNA,或,RNA,样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交,(dot blotting),或狭线印迹杂交,(slot blotting),进行检测，它们是在,Southern,印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸,(DNA,或,RNA),分子的核酸杂交技术。,两种方法的基本原理和操作步骤相同，即通过特殊的加样装置将变性的,DNA,或,RNA,核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性,DNA,或,RNA,。两者的区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品分别为圆斑状和狭线状。,斑点杂交法主要用于基因组中特定基因及其表达情况的定性和定量研究。,与其他核酸分子杂交法相比，斑点杂交法具有简单、快速、经济等特点，一张滤膜上可以进行多个样品的检测，同时也适用于粗提核酸样品的检测，但该法不能用于鉴定所测基因的分子质量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。,(4),菌落,(,或噬菌斑,),原位杂交,菌落,(,或噬菌斑,),原位杂交是直接接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维色滤膜上，不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶解及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使,DNA,暴露出来并与滤膜原垃结合，再与特异性,DNA,或,RNA,探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。,由于生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，然后在原位发生溶菌、,DNA,变性和杂交作用，所以菌落杂交或噬茵斑杂交隶属原位杂交范畴。,原位杂交,(in situ hybridization),*,细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。,*细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。,将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：,DNA/DNA,、,RNA/DNA,、,RNA/RNA,杂交。,特点,能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究,不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高,能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,操作步骤,将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素薄膜上,裂解菌落或噬菌斑并使释放的,DNA,原位结合于滤膜上,固定于滤膜上的,DNA,与标记探针进行杂交,杂交后滤膜的漂洗及放射自显影,溶菌、使,DNA,暴露,洗菌体碎片和,Pr,使单链,DNA,牢固结合在膜上,原位杂交,Southern,印迹杂交是先从转化子中提取总,DNA,，经酶切及琼脂糖凝胶电泳分带，转移到用于杂交的膜上，变性处理后再用,DNA,探针与其杂交。,斑点印迹杂交是把提取的转化子总,DNA,直接点样到用于杂交的膜上，变性处理后再用,DNA,探针与其杂交。,菌落（或噬菌斑）原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂交的膜上，经溶菌和变性处理后使,DNA,暴露出来并与滤膜原位结合，再用,DNA,探针与其杂交。,用,Southern,印迹杂交法不仅可以鉴定重组子中含有重组,DNA,分子，而且还可以知道待检测的,DNA,分子（,DNA,片段）的大小以及待检测的,DNA,片段在重组,DNA,分子中的位置，但是此方法操作比较麻烦。,斑点印迹杂交、菌落（或噬菌斑）原位杂交操作比较简单，但是只能区别是否含有待检测重组,DNA,分子的重组子。,菌落（或噬菌斑）原位杂交已广泛地用于从基因组,DNA,文库和,cDNA,文库中筛选含目的基因的重组子。,四、免疫化学分析检测,如待测的重组子既无任何可供选择的基因表型特征，又无理想的核酸杂交探针时，可采用免疫学方法筛选重组子。,免疫学检测法的基本过程类似于菌落分子杂交，不同的是该法使用抗体探针，而非,DNA,探针。,免疫学检测法专一性强、灵敏度高，但前提条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。,免疫学检测法可分为抗体测定法和免疫沉淀测定法。,(,一,),抗体测定法,1.,放射性抗体测定法,基本依据,一种免疫血清中含有多种类型的免疫球蛋白,IgG,分子，这些,IgG,分子分别与同一抗原分子上不同的抗原决定簇特异性结合。,抗体分子或其某部分可牢固地吸附在固体支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不会被洗脱掉。,通过体外碘化作用，,IgG,抗体会迅速地被放射性,125,I,标记上。,放射性抗体测定法的操作过程,首先将转化的菌体涂布在琼脂平板培养基上，长出菌落后，再影印到另一块琼脂平板上培养。待影印琼脂平板上的菌落长好后，用氯仿饱和气体裂解菌落，使阳性菌落产生的抗原释放出来。将吸附了未经标记的,IgG,抗体的聚乙烯薄膜覆盖在琼脂平板表面，如释放抗原和抗体具有对应关系则在薄膜上形成抗原,-,抗体复合物。小心取下薄膜，再用,125,I,标记的,IgG,处理，,125,I-IgG,便会与结合在聚乙烯薄膜上的抗原决定基结合。漂洗聚乙烯薄膜，去除过剩的,125,I-IgG,，然后于空气中干燥薄膜，经放射性自显影后，即可从母板上就获得所需的重组克隆。,这种方法十分灵敏，抗原含量低至,5pg,仍然可被检测出来。,目前所采用的免疫学检测方法中，更多的是先将待检测的菌落或噬菌斑按原位印迹到硝酸纤维素膜等固相支持物上，然后裂解细胞，使目的蛋白抗原结合到硝酸纤维素膜上，进一步与相应的抗体（即第一抗体）反应，形成抗原,-,抗体复合物。,对抗原,-,抗体复合物的检测，既可采用,125,I,标记的第二抗体直接检测，也可采用,125,I,标记的,A,蛋白进行间接分析。,直接检测法中，针对不同的第一抗体，应分别标记相应的第二抗体进行检测；,间接分析法中，只须标记一种,A,蛋白分子便可检测多种不同的第一抗体（,A,蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种组分，它可以牢固地结合到,IgG,分子的,Fc,段，形成多分子复合物）因此用一种碘化标记试剂可以检测筛选产生不同抗原的重组克隆子，而不必每次标记不同的第二抗体。,五、,PCR,筛选法,在载体,DNA,分子中，外源,DNA,插入位点的两侧序列多为固定已知的，据此设计引物，从初选出来的阳性克隆中提取质粒，进行,PCR,扩增，电泳后即可判断是否连上了外源片段。,