不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.pdf

浙江农业学报 ():/.刘方程 王峰 毕冬琳 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证.浙江农业学报 ():.:/.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()西北民族大学中央高校基本科研业务费项目()甘肃省教育厅高等教育教学成果培育项目()西北民族大学教学改革研究项目()作者简介:刘方程()男甘肃兰州人硕士研究生从事病毒天然免疫机制研究:.通信作者李琼毅:.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证刘方程王 峰毕冬琳杨东亮杨晓莉柏家林李琼毅(西北民族大学.生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室.生命科学与工程学院甘肃 兰州)摘 要:兔出血症是由兔出血症病毒()引起的一种兔急性、高度致死性传染病成年兔死亡率超过 但 周龄幼兔不发病 基于幼年兔与成年兔对 的易感性差异采用串联质谱标记()蛋白质组学技术对幼年兔(周龄)和成年兔(月龄)肝中的蛋白质进行检测和定量分析从幼年兔和成年兔肝中定量获得 个蛋白质筛选出 个差异蛋白质相较于幼年兔成年兔肝中 个蛋白质显著上调 个蛋白质显著下调 功能富集分析结果显示生物学过程主要富集到 个小分子代谢蛋白质、个与氧化还原过程相关的蛋白质和 个参与代谢过程的蛋白质细胞组分主要富集到 个细胞外成分蛋白质、个线粒体蛋白质和 个细胞质蛋白质等分子功能主要富集到 个催化活性蛋白质、个氧化还原活性蛋白质和 个辅酶结合蛋白质等 个差异蛋白质在 数据库中共注释到 条 信号通路主要涉及代谢途径、糖代谢、氧化磷酸化作用和剪切小体等通路 幼年兔和成年兔肝中差异蛋白质互作网络分析发现 的关联度最高且差异蛋白质胆固醇酰基转移酶()在互作网络中具有更多相互作用关系 从蛋白质水平探讨幼年兔和成年兔的感染差异机制筛选并分析幼年兔和成年兔肝中的差异蛋白质筛选出的差异蛋白质有望成为 体外扩增细胞系构建的突破点为构建适宜 体外扩增的细胞系提供新的研究思路关键词:新西兰兔 蛋白质组学兔出血症病毒()肝差异蛋白质中图分类号:文献标志码:文章编号:()(.):().()()().().().:()()兔出血症病毒()是兔出血症()的病原体又名兔瘟 年我国首次报道了兔出血症的流行在之后的 个月内中国约有 亿只家兔因兔出血症死亡该疾病在短时间内传播到约 万 的区域并且在接下来的 年里该病毒在全球范围内传播严重威胁世界范围内养兔业的发展 成熟 为单股正链 病毒呈球形直径约 无包膜表面有典型的杯状凹陷 基因组全长约 含有 个重叠的开放阅读框()编码病毒主要结构蛋白 和 个非结构蛋白、解旋酶、蛋白酶和 依赖的 聚合酶()则编码次级结构蛋白 根据 基因组序列 可分为 和 两个基因群:包括.共 种基因型其中.()和.()是兔感染 的主要病原体.和.无致病性包括欧洲棕兔综合征病毒()和与 相关的非致病性兔杯状病毒()成年兔对.型 易感死亡率达以上但 月龄幼兔感染后发病率较低 周龄幼兔不发病 幼兔对 的易感性随年龄的增加而增加直到 周龄其发病率、死亡率与成年兔一样 幼兔对.型 的天然抗病机制尚不明确但可能与幼兔和成年兔肝结构功能不同 及固有免疫应答差异相关 目前由于没有适宜体外复制增殖的细胞系 致病机制等相关研究进展缓慢正因为幼兔对其存在天然抵抗性故寻找并分析关键的差异蛋白质对 易感性的影响将为其致病机制研究和疫苗研发带来新突破 本文运用串联质谱标记()定量蛋白质组学技术和生物信息学分析对 周龄幼年兔和 月龄成年兔肝中差异蛋白质进行分析旨在从蛋白质水平阐明成年兔和幼年兔对 易感性差异的分子机制为研究 易感染宿主细胞的潜在靶点和 体外扩增细胞系的构建提供新的思路和方法 材料与方法 试验材料未接种 疫苗的 周龄幼年和 月龄成年新西兰兔各 只购自甘肃省水思圆智能科浙江农业学报 第 卷 第 期技工程有限公司 将兔用空气栓塞法处死解剖采集肝组织切成 大小方块用锡箔纸包裹于 保存备用 兔肾细胞系 购自武汉大学中国典型培养物保藏中心()分子标记试剂盒、蛋白质定量试剂盒、乙醇、甲酸、乙腈、丙酮、纳升级肽段分析柱()和 兔单克隆抗体均购自美国赛默飞世尔科技公司羟乙基哌嗪乙磺酸()、十二烷基硫酸钠()、三氟乙酸()和甲酸铵均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司乙二胺四乙酸()、蛋白酶抑制剂()、二硫苏糖醇()、碘乙酰胺()和测序级胰蛋白酶()购自上海普洛麦格生物产品有限公司三乙基碳酸氢铵()和 氨水购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司 除盐柱()和高 反相色谱柱均购自上海沃特世有限公司尿素购自美国英杰生物技术有限公司 鼠单克隆抗体、鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、兔单克隆抗体和 鼠单克隆抗体均购自 公司 兔单克隆抗体、山羊抗鼠 和山羊抗兔 购自上海睿铂赛生物科技有限公司 高敏 发光底物购自北京四正柏生物科技有限公司磷酸缓冲盐液(值 )、电转液、裂解液和 缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司 蛋白质提取、酶解将 保存的肝组织研磨后加入 裂解液放于冰上超声破碎 、离心 取上清液使用 蛋白质测定试剂盒对蛋白质进行定量检测 吸取 蛋白质溶液添加 三乙基碳酸氢铵()至 加入二硫苏糖醇()至终浓度为 还原 加入碘乙酰胺()至终浓度 室温避光孵育 加入预冷丙酮沉淀蛋白质离心收集沉淀加入 丙酮、乙醇溶液混悬沉淀 沉淀 以上离心、收集沉淀加入 溶液复溶沉淀加入胰蛋白酶 反应 酶解蛋白质悬浮液 肽段标记根据 分子标记试剂盒说明书对每个样品肽段进行标记将 试剂溶于 异丙醇取 样品肽段加入已溶解的 试剂于室温下反应 后加入 超纯水终止反应随后将样品离心真空冷冻干燥 标记肽段除盐将标记后的干燥样品溶于 、乙腈溶液使用 、乙腈活化除盐柱加入 、乙腈溶液平衡除盐柱将重溶样品加入除盐柱内使样品缓慢流过除盐柱标记肽段被除盐柱捕集盐和其他非疏水性小分子流出、舍弃 再添加 、乙腈溶液清洗除盐柱洗去残留盐类 添加 、乙腈溶液使液体缓慢流过除盐柱将肽段洗脱下来使用新 管收集洗脱溶液 最后将洗脱溶液冷冻干燥去除乙腈 反相色谱分离与质谱用 公司的 超高效液相色谱系统进行分离高 流动相 为 值 的 甲酸铵高 流动相 为 值 的 甲酸铵、乙腈色谱柱为超高效色谱柱()上样量 流速 紫外光谱检测 结束色谱分离后用 质谱分析肽段 离子源喷雾电压为 质谱仪加热毛细管设定温度为 采用数据依赖模式自动在 和/间切换采集条件设置:最大进样时间 全扫描分辨率 /分辨率 母离子扫描范围 /碰撞能量 蛋白质鉴定和定量检测将质谱数据输入到 ()软件()后软件先对质谱图进行筛选 软件提取后的谱图用 ()进行搜索搜索结束后 软件根据 搜索结果和质谱图进行定量分析 蛋白质组学原始数据库已通过 存储库存入国际蛋白质组学共享联盟()项目 号为 刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证 生物信息学分析 功能注释使用 软件和 数据库(:/./)对筛选出的差异蛋白质进行搜索然后利用 进行定位和注释 通路注释将筛选出的差异蛋白质在京都基因与基因组百科全书 数据库()(./.)进行对比对目标蛋白质进行 归类并获取目标蛋白质序列参与的通路信息 蛋白质互作网络()分析利用(:/./.)和(:/./)数据库查找差异蛋白质之间的直接和间接相互作用关系 使用 软件进一步分析功能性蛋白质相互作用网络并计算每种蛋白质的丰度以评估蛋白质在网络中的重要性构建差异蛋白质的网络互作图 差异蛋白质 验证收集生长状态良好的 细胞、成年家兔和幼年家兔肝组织用(含 蛋白酶抑制剂)裂解液裂解制备好的蛋白质样品分别加入 胶上样孔中每孔上样量为 设置恒压 电泳 电泳完成后用伯乐半干转膜仪、条件下转膜 转印至 膜 用脱脂奶粉封闭 后加入差异蛋白质单克隆抗体 孵育过夜用 洗膜 次加入 标记的二抗室温孵育 用 洗膜 次用电泳凝胶成像分析系统显色 数据分析对筛选得到的差异蛋白质进行 检测检测结果采用()软件进行灰度分析其余数据均使用 软件进行多组间单因素方差分析()分析 结果与分析 差异蛋白质的筛选与鉴定本试验共鉴定了 个蛋白质筛选出 个具有统计学意义的差异蛋白质 相对于幼年兔成年兔肝中显著上调表达蛋白质 个显著下调表达蛋白质 个差异蛋白质表达火山图和热图如图 所示 根据 种月龄兔肝中蛋白质定量比值将筛选出的差异蛋白质进行排序筛选出了比值最大的 个差异蛋白质其中醇 脱 氢 酶()、角蛋白()、角蛋白()和组蛋白结合蛋白()共 个蛋白质的表达显著上调胆固醇酰基转移酶 ()和热休克蛋白()的表达显著下调(表)差异蛋白质 富集分析 富集分析结果显示 种差异蛋白质主要富集到生物学过程()、细胞组分()和分子功能()大类(图)中小分子代谢()蛋白质 个、氧 化 还 原 过 程()蛋 白 质 个、代 谢 过 程()蛋白质 个 中细胞外成分()蛋白质 个、线粒体()蛋白质 个、细胞质()蛋白质 个 中催化活性()蛋白质 个、氧化还原活性()蛋白质 个、辅酶结合()蛋白质 个(图)信号通路注释结果对成年兔和幼年兔肝中的 个差异蛋白质进行通路富集分析结果共注释到 条 信号通路排名前 的通路如表 所示 其中代谢途径()通路中富集的蛋白质差异极显著()且富集的蛋白质数量较多剩余通路主要包括糖代谢()、氧化磷酸化()、剪切小体()等 差异蛋白的 构建分析由成年兔和幼年兔肝中差异蛋白质相互浙江农业学报 第 卷 第 期差异蛋白火山图差异蛋白聚类热图 .图 差异蛋白质的筛选与鉴定.作用网络结构图和柱形图(图、)可看出关联度排名前 位的差异蛋白质分别是线粒体核糖体蛋白 ()、人核糖体蛋白(刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证 )、线粒体核糖体蛋白()、核糖体蛋白()、泛醌氧化还原酶亚单位()、线粒体核糖体蛋白()、小核糖核蛋白多肽()、核糖体蛋 白()、线粒体核糖体蛋白()、线粒体核糖体蛋白()关联度最高的是 以上蛋白质均为核糖体蛋白质其功能聚类于细胞功能调控方面 差异蛋白质的验证根据蛋白质组学分析结果用成年兔、幼年兔肝组织和 周龄幼兔肾细胞系()作为样品对筛选获得的 个差异蛋白质(、和)进行蛋白质表达水平验证 结果表明:幼年兔组和 组的、蛋白表达水平均极显著()低于成年兔组且 组的、蛋白表达水平极显著()低于幼年兔组(图、图、)幼年兔组和 组的 蛋白表达水平极显著低于成年兔组且 组显著()低于幼年兔组(图、)幼年兔组和成年兔组的 蛋白表达水平均极显著()低于 组幼年兔组 蛋白表达水平极显著()低于成年兔组(图、)成年兔组、组的 蛋白表达水平极显著()低于幼年兔组 组的 蛋白表达水平极显著降低于成年兔组()(图、)幼年兔组和 组的 蛋白表达水极显著()(图、)表 未感染的成年兔肝中部分差异蛋白质 蛋白质 蛋白质名称 表达情况醇脱氢酶 上调 角蛋白 上调 胆固醇酰基转移酶 下调 角蛋白 上调 组蛋白结合蛋白 上调 热休克蛋白 下调 合成酶、转运、线粒体 复合体、亚单位 下调 羟基甲基戊二酰 合成酶 下调 羟基酰基 脱氢酶三功能多酶复合体亚基 下调 组蛋白 簇 下调 葡萄糖焦磷酸化酶 上调 亚甲基四氢叶酸脱氢酶上调 苹果酸脱氢酶 下调 脯氨酰 羟化酶亚基 下调 热休克蛋白 家族成员 下调 谷胱甘肽 转移酶 上调 环氧化物水解酶 上调 前列腺素()还原酶样()上调 丝氨酸羟甲基转移酶 上调 丙氨酸乙醛酸氨基转移酶 下调 浙江农业学报 第 卷 第 期差异蛋白质 富集分析分类直方图差异蛋白质 富集分析分类气泡图 生物学过程细胞组分分子功能 .图 差异蛋白质 富集分析结果.刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证表 通路注释中差异蛋白质数量排名前 的通路 通路名称 差异蛋白数量 代谢途径 糖代谢 氧化磷酸化 帕金森氏症 剪切小体 阿兹海默病 丙酸代谢 乙氧基化物和二甲酸酯代谢通路 类固醇生物合成 丁酸盐代谢通路 结论与讨论 是一种在全球范围传播的兔急性、高度致死性传染病对家兔养殖业造成了巨大经济损失 疫苗是预防兔出血症的主要手段但目前为止仍尚未构建出允许体外培养 毒株的细胞系 因此深入研究 感染后的体液和细胞免疫机制比较幼年兔和成年兔感染 的机制可为合理开发 疫苗提供基础理论依据病毒感染是一个极为复杂的过程涉及基因、蛋白质、代谢物等物质的相互作用蛋白质组学可较全面地揭示生物系统中差异蛋白质对病毒感染的影响 目前基于质谱技术的蛋白质组学定量方法有同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学()、多重反应监测技术()、和平行反应监测()等其中 是赛默飞世尔科技()公司推出的一种基于体外同位素标记的相对与绝对定量蛋白质组学技术即利用同位素试剂标记蛋白质酶解后产生的多肽可同时分析多达 种样品间的蛋白质表达量具有不依赖抗体、可同时测定多样品多目标易形成标准化操作等优浙江农业学报 第 卷 第 期差异蛋白质互作网络图差异蛋白质互作连接度直方图 .图 差异蛋白质的 网格结构图和互作连接度直方图.点应用最为广泛 本研究采用 技术对成年兔和幼年兔肝中的差异蛋白质进行了筛选和分析共鉴定出 个蛋白质筛选出 个具有统计学意义的差异蛋白质其中 个显著上调 个显著下调 差异蛋白质 功能注释生物学过程中主要富集到小分子代谢、氧化还原过程和代谢过程细胞组分中主要富集到细胞外成分、线粒体和细胞质分子功能中主要富集到催化活性、氧化还原活性和辅酶结合 通路数据库分类注释到 条 信号通路主要涉及代谢途径、糖代谢、氧化磷酸化、帕金森氏症、剪接体、阿兹海默病和丙酸代谢等通路结合文献报道本课题组对角蛋白、角蛋白、热休克蛋白、胆固醇酰基转移酶、醇脱氢酶和组蛋白结合蛋白进行后续验证热休克蛋白 属于热休克蛋白家族参与细胞增殖、细胞器蛋白稳定、凋亡、蛋白质的囊泡运输和神经退行性疾病等多个生理病理过程已有研究表明热休克蛋白家族作为一种细胞外的免疫原可引起主要组织相容性复合体()交 叉 呈 递 抗原 等研究发现感染 .株后幼年家兔肝中的杀伤细胞受到激活相关功能基因(、和)表达下调推测幼年家兔肝内 上调后虽然会活化杀伤细胞但由于相关基因被下调不会诱导过强的炎症反应来阻碍 .株感染 本研究中幼年兔肝内 表达上调推测感染.株后幼年兔可同时活化 细胞、细胞和自然杀伤细胞激活特异性细胞免疫进而阻碍病毒感染 此外也有研究表明 是坦布苏病毒()在鸡成纤维细胞()上的病毒受体推测 可能与病毒进入细胞有关线粒体核糖体蛋白()是存在于真核细胞线粒体内的一种核糖体与线粒体蛋白的翻译相关 研究表明线粒体核糖体蛋白可以与 结合促进 活化并且可以刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证醇脱氢酶角蛋白 角蛋白 胆固醇酰基转移酶 组蛋白结合蛋白 热休克蛋白成年兔幼年兔、分别表示在 、和 水平差异显著 .图 成年兔和幼年兔肝、周龄幼兔肾组织细胞系()的差异蛋白表达水平.()从线粒体转运到细胞质并促进/的 连接泛素化 等对先天免疫因子基因的表达分析表明幼年家兔和成年家兔在感染 .株或.株后不同的抵抗效应正是基于这些早期免疫调节过程 本研究中根据 分析 关联度最高推测由于幼年兔肝中 表达较高当受到 刺激后可能通过 与 的互作进一步促进 的活化激活天然免疫并拮抗病毒感染 在幼年兔对 .株的应答中型和干扰素诱导的基因上调导致 和自然杀伤细胞的激活活性增强这些结果可能与幼年兔对 .株不具有感染性相关 相反在感染 .株后幼年家兔肝中 型和干扰素诱导的基因下调这可能与幼年家兔对 .株具有感染性有关角蛋白()属于角蛋白家族是消化系统中最大的中间丝蛋白和细胞骨架的主要组成部分 李文静等研究发现丙型肝炎病毒()感染可导致角蛋白 表达上调从而反过来促进 自身的复制并且下调角蛋白 具有抗 作用并增强抗 药物的抗病毒作用 等研究发现角蛋白 突变体在慢性乙型肝炎病毒()感染后表达上调其突变体可能阻止细胞骨架的组装并增加人体对急性肝衰竭的易感性 胆固醇酰基转移酶(也称为浙江农业学报 第 卷 第 期甾醇酰基转移酶)主要功能是催化胆固醇酯的形成并在体内发挥多种功能包括调节胆固 醇 的 储 存 和 细 胞 胆 固 醇 的 内 稳 态 等研究发现胆固醇酰基转移酶 抑制剂可抑制诺如病毒()复制说明胆固醇酰基转移酶 和 复制相关 组蛋白结合蛋白()是一种新的 结合蛋白参与转录翻译和 降解复制依赖性组蛋白 是其唯一已知的靶点 等研究发现感染者的血浆中 水平与组蛋白结合蛋白水平呈负相关说明组蛋白结合蛋白是 潜在的重要细胞调节因子 等研究发现 能够利用组蛋白结合蛋白作为另一种途径来协助病毒粒子的产生 这些差异蛋白质目前没有与 感染机制相关的报道我们将在后续的实验中进行逐一探索本文采用 标记定量蛋白质组学筛选鉴定出了成年兔和幼年兔肝中的差异蛋白质并对其进行了相应的生物学分析有助于进一步了解差异蛋白质在 感染中的作用为 体外扩增细胞系构建提供新的研究思路 差异蛋白质筛选仅仅迈出了第一步后续还需在细胞水平上进行差异蛋白质对病毒感染影响的验证参考文献():.():.():.():.():.:.():.():.().(/):.:.():./.:.():.:.():.():.():.().(/):.().():.():.:.():.:刘方程 等.不同月龄新西兰兔肝中差异蛋白质鉴定与验证 .():.:.(/):./.:.:.:():.():.():.:.:.:.():.():.():.李文静 李健蕊 黄梦昊 等.细胞角蛋白 对丙型肝炎病毒复制的影响.药学学报 ():.():.().:.:.():.:.():.():.(责任编辑 侯春晓)浙江农业学报 第 卷 第 期