血尿分泌物培训课件.docx

血液常规检查的基础知识
一、红细胞（RBC）计数意义
红细胞增多见于：
（1）血液中红细胞绝对值增多，见于真性红细胞增多症；
（2）机体长期缺氧，如慢性肺源性心脏病、发绀性先天性心脏病引起继发性红细胞增多；
（3）因一时性血浆中水分丢失过多、血液浓缩，如剧烈吐泻、脱水、烧伤引起相对性红细胞增多。
红细胞减少见于各种原因引起的贫血，如骨髓造血功能障碍，造血原料缺乏，红细胞破坏过多、过早等。
二、血红蛋白（Hb）测定意义其增减的意义大致与红细胞增减相似，但在各种不同类型贫血时，红细胞数与血红蛋白量的减低不一定呈平行关系。如小红细胞性贫血时，血红蛋白含量比红细胞数减少更为明显；在大红细胞性贫血时，则红细胞减少的程度较血红蛋白减少更为严重。
三、红细胞形态学检查
红细胞大小异常包括：
1.小红细胞，直径小于6μm，厚度薄，常见于缺铁性贫血。
2.大红细胞，直径大于10μm，体积大，常见于维生素B12或叶酸缺乏引起的巨幼红细胞性贫血。
3.红细胞大小不均，大小相差1倍以上，常见于各种增生性贫血，但不见于再生障碍性贫血。
红细胞形态异常包括：
1.球形红细胞，直径缩小，厚度增加，常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血。
2.靶形红细胞，呈靶形，主要见于珠蛋白生成障碍性贫血、某些血红蛋白病、脾切除术后等
3.椭圆形红细胞，长径增大，横径缩小，呈椭圆形，见于遗传性椭圆形细胞增多症，也可见于巨幼红细胞性贫血。
4.镰形红细胞，如镰刀形、柳叶状等，主要见于镰形红细胞性贫血。
5.红细胞缗线状形成，呈平行叠串状排列，见于骨髓瘤、高球蛋白血症、高纤维蛋白血症等。
红细胞染色异常，红细胞染色深浅反映着血红蛋白含量，包括：
1.低色素性，红细胞内含血红蛋白减少，见于缺铁性贫血及其他低色素性贫血。
2.高色素性，红细胞内含血红蛋白较多，多见于巨幼红细胞性贫血。
3.嗜多色性，是未完全成熟的红细胞，呈灰蓝色，体积稍大，见于骨髓造红细胞功能旺盛的增生性贫血。
红细胞结构异常包括：
1.嗜碱性点彩，见于重金属（铅、铋、银等）中毒，硝基苯、苯胺等中毒及溶血性贫血、恶性肿瘤等。2.卡波（Cabot）环，可能是幼红细胞核膜的残余物，见于溶血性贫血、某些增生性贫血。
3.何-乔（Howell-Jolly）小体，可能是细胞核的残余物，见于巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血及脾切除术后。
四、白细胞（WBC）计数意义
白细胞增多见于：
⑴急性感染：包括化脓菌感染、杆菌感染引起肾孟肾炎、胆囊炎等，病毒感染引起传染性单核细胞增多症、乙型脑炎等，寄生虫感染引起急性血吸虫病，螺旋体病引起的钩端螺旋体病等，重度感染时可引起白细胞总数显著增高并可出现明显核左移。
⑵严重烧伤、较大手术后、心肌梗死等引起的组织损伤、坏死。
⑶数量极度增高时，见于恶性肿瘤、白血病，尤其是慢性白血病。
⑷见于急性失血，尤其是内脏破裂、宫外孕等引起的内出血。
⑸见于急性化学药物有机磷中毒，也见于糖尿病酮症酸中毒、尿毒症等引起的代谢性中毒。
白细胞总数减少见于：
⑴革兰阴性杆菌感染，如伤寒、副伤寒沙门菌，病毒感染，如流感、病毒性肝炎，寄生虫感染，如疟疾等。
⑵某些血液病，如再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、白细胞不增多型白血病等。
⑶自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、免疫抗体导致的白细胞减少。
⑷理化损伤及药物反应，如苯及其衍生物引起的放射线损伤、化学品中毒，如氯霉素、保泰松、抗癌药等引起的各种反应。
⑸其他，如肝硬化、脾功能亢进等。
五、白细胞分类（DC）意义
中性粒细胞（N）总数的增多或减少的临床意义与白细胞相似。
⒈嗜酸性粒细胞（E）增多见于：
⑴过敏性变态反应，如支气管哮喘、药物性皮疹、血管神经性水肿、血清病等。
⑵寄生虫病，如肠道寄生虫钩虫、蛔虫等。
⑶某些皮肤病，如湿疹、天疱疮、剥脱性皮炎等。
⑷急性传染病恢复时，一般在常起病时细胞数减少，当开始恢复时可呈现增多，提示病情好转。
⑸某些血液病及恶性肿瘤，如慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤、肺癌等。
⒉嗜酸性粒细胞减少见于：
⑴当肾上皮质功能亢进或应用肾上腺皮质激素治疗时。
⑵急性发热性传染病，尤其在伤寒、副伤寒、严重烧伤、大手术后。
嗜碱性粒细胞
（B）增多见于：
⑴某些血液病如慢性粒细胞性白血病、红细胞增多症；
⑵脾切除术后、疫苗预防注射后等。嗜碱性粒细胞减少一般无临床意义。
1.淋巴细胞（L）增多见于：
⑴初生婴儿、儿童的生理性增多；
⑵某些血液病如再生障碍性贫血、粒细胞减少症可引起淋巴细胞相对性增多；
⑶某些感染，如病毒感染性疾病、细菌性感染如百日咳、慢性感染如结核病的恢复期；
⑷急、慢性淋巴细胞性白血病。
2.淋巴细胞减少大多是相对性减少，或见于长期接触放射线或应用肾上腺皮质激素治疗后。
单核细胞（M）增多见于：
⑴某些感染如结核病活动期，亚急性细菌性心内膜炎、疟疾等；
⑵某些血液病，如淋巴瘤、高雪病、单核细胞性白血病且可出现原、幼单核细胞。单核细胞减少一般无特殊临床意义。
六、白细胞的常见形态变化
中性粒细胞的核象变化包括：
⑴核左移，常见于感染，尤以急性化脓性感染最常见，其他如急性中毒、急性溶血时也可出现。
⑵核右移，主要见于营养性巨幼红细胞性贫血、使用抗代谢药物治疗后、感染恢复期等。
中性粒细胞的形态异常包括：
⑴中毒颗粒：常见于严重的化脓性感染、大面积烧伤等。
⑵空泡变性：常见于严重感染，特别是败血症，因粒细胞受损发生脂肪变性所致。
⑶核变性，临床意义同空泡变性。
⑷棒状小体，仅见于白血病细胞中，但在急性淋巴细胞白血病则不出现棒状小体。
淋巴细胞形态变异根据形态特点分为3型：
Ⅰ型（空泡型）、Ⅱ型（不规则型）、Ⅲ型（幼稚型）。除以上3型外，尚可有呈浆细胞样或组织细胞样的异形淋巴细胞，见于：
⑴病毒感染性疾病；
⑵某些细菌性感染，原虫、螺旋体感染；
⑶某些免疫性疾病、药物过敏等。
七、血小板计数意义
血小板减少见于：
⑴血小板生成减少，如再生障碍性贫血、急性白血病、骨髓纤维化、放射线损伤；
⑵血小板破坏过多，如免疫性血小板减少性紫癜、过敏性药物损伤；
⑶血小板消耗过多，如弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜；
⑷血小板分布异常，如脾肿大、输入大量血浆血液受稀释等。
血小板增多见于：
⑴急性大失血和溶血后可呈反应性增多；
⑵骨髓增生病，如原发性血小板增多症、慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症等。
八、 血小板学形态检查正常血小板呈圆形或椭圆形，直径2～4μm，含嗜天青颗粒。功能正常的血小板多数个成簇聚集，若呈单个分散分布提示血小板功能不良。幼稚血小板体积大，胞质蓝色加深。当血小板异常增生时，呈大小不等，形态异常。

血常规检验中的注意事项
血细胞检验是指对血液中白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HGB）及相关数据的计数检测分析，也称血常规检验。血常规检验不仅是诊断各种血液病的主要依据，而且对其它系统疾病的诊断和鉴别也可提供许多重要信息，是临床医学检验中最常用、最重要的基本内容之一。血常规检验的最原始的手段是通过显微镜人工镜检，随着基础医学的发展，高科学技术的应用，血液细胞分析仪已成为取代镜检进行血常规分析的重要手段，尤其是带分类的血液分析仪。
无论是镜检、还是使用血液分析仪，要获得血常规检验的稳定可靠、准确的数据，防止临床诊疗人出错误的判断，实验室检验要充分考虑影响血常规检验中的多种影响因素，并严格加以控制：
一．标本的采集
为了取得准确、可靠的检验结果，必须取得高质量的标本。高质量的标本是高质量检验的第一步。保证血液标本中各项细胞的完整形态是作为血常规检验用的高质量的标本的最基本的要求。血液细胞检验标本的制备分为采集和抗凝2个步骤。
1．标本的采集
按采血部位的不同，取得血常规检验标本，最常用的途径是静脉采血和末梢毛细血管采血。各类文献均表明，静脉血血样是最可靠的标本，手指血是末梢毛细血管血样中与静脉血差异最小且较为稳定的血样。有研究表明，与静脉血相比，手指血的准确性和可重复性仍然较差：白细胞计数明显高（+8%）而血小板计数明显低（-9%）。因此，绝大多数专家建议：血常规检验特别是应用血液分析仪时，应使用静脉血。
2．标本的抗凝
用于血常规检验的血样必须经抗凝剂抗凝处理，在目前的众多抗凝剂中，EDTA盐（EDTA-Na2,EDTA-K2,EDTA-K3）是对白细胞形态和血小板影响相对较小的抗凝剂，最适合用于血常规检验。除采血因素的影响（生理性因素、采血部位等）外，多数情况下，血样的质量取决于血液和抗凝剂的比例。血液比例过高时，由于抗凝剂相对不足，血浆中出现微凝血块的可能性增加，在用于血细胞分析仪时，微凝血块可能阻塞仪器，同时影响一些检验指标。血液比例过低，抗凝剂相对过剩，对检验指标会造成严重影响。血液经EDTA抗凝后，白细胞的形态会发生改变，这种改变和时间及EDTA浓度有关。EDTA的最佳浓度（与血液比）为1.5mg/ml,如果血样少，EDTA的浓度达到2.5mg/ml，中性粒细胞肿胀、分叶消失，血小板肿胀、崩解、产生正常血小板大小的碎片，这些改变都会使血常规检验和血细胞计数得出错误结果。这一点在用自动血细胞分析仪时尤为重要。
静脉血和末梢血均可经抗凝剂抗凝成全血标本（标本中不含稀释液，或对标本造成的稀释的影响极小），显而易见，末梢血抗凝标本要达到合适的血液和抗凝剂的比例是非常困难的。因此，多数专家建议，在制备全血比例是非常困难的。因此，多数专家建议，在制备全血标本时，应使用定量的含EDTA盐的真空采血管采集静脉血。
无论镜检，或是使用血液细胞分析仪，由于绝大多数的对标本稀释的稀释液中含有抗凝剂，在一定量的稀释液中可直接加入微量静脉血或末梢血液（10-40μl）即可制备成通常所说的预稀释标本。多数情况下，预稀释标本的制备适用于末梢血的血样。
二．标本的稀释
血液是由血细胞和血浆两部分组成的红色粘稠混悬液。在进行血细胞检验计数时，直接用血液计数是困难的，无论是镜检还是用血细胞分析仪，血液均需合适准确的稀释后才能进行血细胞的检验计数。基于血细胞分析仪的基本原理，在血细胞分析仪的设计应用中，稀释倍数和计数容量是最重要的设计指标之一。
自50年代初，美国库尔特先生研制了电阻法（小孔原理）血细胞分析仪以来，血细胞的稀释液为介质的流动的形式通过传感器测量计数（如图-1），血细胞通过传感器时一定需要排队通过，否则可能就会造成重合损失（如图-2）。
实际应用时，是将血液稀释于稀释液中形成稀释标本（稀释比为1：N），以流动检测的方式测出一定量（V）的稀释标本内的血细胞数（T），经换算后得出血液中的细胞浓度（L）：L-T×N/V。
由此可见，准确合理的稀释倍数（在用于仪器时，RBC、PLT的稀释倍数一般为1：10000至1：3000；WBC、HGB的稀释倍数一般为1：250左右）和准确、稳定的测量容量是血细胞检测的又一重要基础。稀释倍数过低，会形成细胞排队通过传感器的重合缺损；稀释倍数过大，则会造成一定测量容量内血细胞的数量过少，这都会严重影响血液细胞检验的测量精度。
三．标本的储存
如前文所述，抗凝剂因时间和浓度的不同，会造成对血细胞形态的影响。有研究表明，用EDTA抗凝静脉血标本，在标本收集后的5分钟内或30分钟后，8小时内（室温）检测，可以得到最佳的检测结果。如果不需要血小板和白细胞分类的准确数据，则标本可以在2℃-8℃的条件下存入至24小时。
预稀释标本一般需要在标本制备后10分钟内予以测量；如果稀释液中添加细胞稳定剂，预稀释标本的存放时间也不可超过4小时。
总之，影响血常规检验结果的因素很多，要想取得准确的检验数据，就要在实验的每一个步骤中都严格按照操作规程进行。
血液标本的采集及运送是保证结果的重要环节
血液标本的采集及运送是保证结果的重要环节，正确的血液常规标本的采集、接收及保存，使标本中的待测成分不受影响，保证检测结果准确可靠。范围适用于血液白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、红细胞比积、红细胞体积分布宽度、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、平均红细胞体积、血小板体积分布宽度、血小板压积、白细胞分类、嗜酸细胞计数。
采血时凡位于体表的浅静脉均可作为采血部位，通常采用肘部静脉，肘部静脉不明显时，可用手背静脉或内踝静脉。幼儿可于颈外静脉采血。采血处应避免有皮肤红肿、溃疡等现象。采血时如病人检测项目多，应先采常规血，防止血小板发生聚集。止血带压迫时间不能过长，最好不超过0.5 min，以避免瘀血和血液浓缩（有试验证明，压迫时间过长，可引起纤溶活性增强，血小板释放及某些因子活性增强，影响某些实验结果）。最好采用封闭式真空采血器，既有利于标本的收集运送和保存，又便于防止血液交叉感染。抽血时避免产生大量泡沫，否则可能导致溶血。溶血标本会造成红细胞计数降低，红细胞比积降低。血液抽出后立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，以防血液凝固。血液检查的标本量与抗凝剂比例要合适。血液比例过高时，血浆中容易出现微凝血块，可能阻塞血细胞分析仪，同时影响一些检验结果。血液比例过低，抗凝剂相对过剩，会引起血细胞形态和体积的一些改变，这些改变会使血常规检验得出错误结果。
血液标本的保存与运送。血常规血液标本采集后应立即送检，如不能及时送检或分析，必须采取保存措施，应在4℃~8℃低温冰箱冷藏，但低温保存不要超过4 h，保存条件非常重要，不适当保存直接影响实验结果。标本应由检验人员或临床医护人员采集，住院病人标本应有明确标记，与医师申请单内容相符。标本运送要做到专人专送。
血涂片的制备
将血标本均匀地涂抹在清洁干燥的载玻片上，经染色后在显微镜下检查，这是血细胞形态学检查的基本方法，临床应用很广，特别是对各种血液病的形态学诊断很有价值。但是，如果血徐片制备不良，染色不佳，常使血细胞的形态学鉴别和诊断发生困难，甚至导致错误的结论。如血膜过厚，细胞重叠缩小；血膜太薄，白细胞多集中于边缘。因此，制备厚薄适宜、分布均匀的血涂片是血液学检验的基本技术之一。
一、载玻片的清洁
新载玻片上常有游离碱质，必须用约lmol／L HCI浸泡24h后，再用清水彻底冲洗，干燥备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或合成洗涤剂的清水中煮沸20min，再用热水将肥皂和血膜洗净，用清水反复冲洗，干燥备用。如急用载玻片，可将其置0、9乙醇中浸泡lh，用蒸馏水洗净后，擦干或烘干备用。使用载玻片时，只能手持玻片边缘，切勿用手触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。
二、制作血涂片的标本
血涂片既可由非抗凝的静脉血和毛细血管血制备，也可由EDTA抗凝血制备。EDTA抗凝血中，钙离子被螫合后，能阻止血小板聚集，推片时血小板均匀平铺，显微镜下易于对血小板进行观察评价。但有时可观察到因EDTA引起的红细胞皱缩及白细胞丛集现象。但随着血液分析仪的逐步普及，血标本多为EDTA抗凝血，除作全血细细胞计数及多参数分析外，制备血涂片也非常方便，虽有上述弊端，但显微镜下易于发现。
三、血涂片的制备
血涂片的制备方法很多，如手工推片法、自动推片法、载（盖）玻片压拉法、旋转涂片法、棕黄层（buffy－coat）涂片法及厚血膜涂片法等，现介绍如下。
1、手工推片法取血标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持25～30o的平面夹角，平稳地将血向前推动，血液即在载玻片上形成一薄层血膜。将制成的血膜在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。
一张良好的涂片，要求厚薄适宜，头体尾分明，边缘整齐，两侧应留有空隙。玻片的一端应留有贴标签的地方。涂片的好坏与血滴大小、推片与载片之间角度、推片时的速度有关。血滴大、角度大、速度快，则血膜厚；反之则血膜薄。血膜分布不匀，主要是推片边缘不齐、用力不匀或载玻片不清洁所致。
2、载玻片压拉法取两张贴有标签的载玻片备用，将血液滴于一张载玻片的近中央处，立即将另一载玻片于之贴合，四角对齐，标签一端一个，使贴合后的玻片间留下如标签一样厚的间距。先将血滴沿纵向轻压展开，再将两玻片横向均匀拉开，得到两张血膜。此法最适用于血细胞的活体染色，预先将染料滴加在玻片上，干燥后备用。涂制时先将血液与染料混染一段时间，再按上述方法制成血涂片，显微镜下检查，如网织红细胞的检验。
3、旋转器涂片法旋转涂片器的基本结构是：在与电动机转轴垂直的方向装一水平转盘，正中夹置载玻片。徐制时将血标本滴加在载玻片的中央，开动旋转涂片机，在规定的时间内即可制备一张良好的血涂片。对该仪器的要求应具有低惯性高转矩，开动时能立即加速（5000r／min），关机时能迅速停止（O、25s内）。使用这种仪器涂片，白细胞及红细胞能均匀分布在玻片上，且形态保持完好。
4、棕黄层涂片法为了获得较多的有核细胞，使用离心的方法，将EDTA抗凝血作分层离心（RCF—2260g，5min），取红细胞层上的棕黄层（有核细胞和血小板集中层，）作标本，用手工推制成涂片供检查用。
5、厚血膜涂片法从指尖或耳垂取血1滴（约20ul）于载玻片中央，用推片的一角将血由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1、5cm的圆形血膜，自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使红细胞溶解，脱去血红蛋白。倾去水后血膜呈灰白色，干后染色镜检。厚血膜片因取血量多，待检成分较集中，因此特别适合于疟原虫、丝虫的微丝蚴等的检查。
血细胞常用的染色方法
细胞涂片，在用普通光学显微镜观察之前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持其原有结构不发生变化。染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞质、细胞核、细胞器等染上不同的颜色，便于显微镜下观察。各种细胞涂片，常用的染色方法有瑞氏（Wright）、姬姆萨（Giemsa）、巴氏（PaPanicolaou）和苏木素一伊红比emat0Xylin eosin，HE）染色。
一、染料与染色
染料（dyes）是一种具有颜色的有机化合物，最早用于织物的着色。随着生物医学的不断发展，显微镜技术的出现和逐步完善，科学家们用染料将生物组织细胞和病原体着色，以利在显微镜下观察各种结构，这种染料称为生物学染色剂（biology stains，BS），生物染色剂的发现和利用促进了医学生物学的进一步发展。
（一）细胞学的基本染料
染料可分为两大类，即天然染料和人工合成染料。生物染色剂多属于后者。各种生物学染色剂都具有产生颜色和与被染组织亲合两种性质。这两种性质主要由两种特殊基团即发色基团（chromophoro）和助色基团（auxochrome）所产生。
所谓发色基团，是染料产生颜色标志的未饱和基团。不同的有机化合物可以吸收不同波长的光，如吸收可见光区以外的光，这些物质是无色的；如吸收可见光区内某些波长的光，这些物质是有色的，其肉眼可见的颜色为被吸收光颜色的互补色。一般饱和芳香族化合物很少有可见光区的吸收带，因而无颜色可见。相反，如苯的衍生物则具有此吸收带而呈现颜色。这些化合物显示的吸收带与不稳定价键（如π键）有关。对苯二酚是无色的，但氧化失去两个氢原子时变为具黄色的对醌式结构，这种使有机化合物在可见光区内产生光吸收的基团称为发色基团，常见的发色基团有烯基、炔基、羰基、偶氮基、亚硝基等。助色基团是一种能使化合物发生电离作用的辅助原子团，能与发色基团构成更完整的共轭体系，使分子激发能进一步降低，染料的色泽加深并使其与被染组织更具亲合力，染料的助色基团是使染料成为盐类的部分，助色基团的性质决定染料在水溶液中的荷电性，常见的助色基团有羟基、竣基、氨基等。根据助色基团的性质，将生物学染色剂分成碱性染料和酸性染料两大类，即能接受质子者为碱性染料，能释放质子者为酸性染料。
1、碱性染料（basic dyes）属苯胺类蓝色染料，如噻嗪（thiazins）系列，包括亚甲蓝（methylene blue）、天青A（azure　A）、天青B（azure B）、天青C（azure C）和硫堇（thionine），它们的区别在于结合甲基的数量。以天青B为例，它含有两个发色基团，一个次氨基（－N一）和一个邻醌式基团。助色基团为氨基（一NH2），结合一个质子后荷正电，亦称阳离子染料。因此，这些染料与细胞内的酸性成分，如DNA、RNA、特异的中性颗粒基质、某些胞浆蛋白等结合，主要是染细胞核的染料。还有一个很重要染核染料是苏木（hematoxyline），属媒染料（mordant dyes），需媒染剂（如Al3+）参与才能使细胞核着色。
2、酸性染料（acid dyes）细胞学较重要的酸性染料有两大类，即荧烷一氧杂蒽染料（horane－xanthene dyes）和偶氮染料（azodyes）。前者是一类以氧杂蒽和醌式苯环作为发色基团，以羧基（－COOH）为助色基团的染料，因为羧基能提供一个质子，亦称“阴离子染料”。这类染料的代表是伊红Y（eosin Y，俗称黄色伊红）和伊红B（eosin B，俗称蓝色伊红）。这两种染料特别适于与噻嗪类染料（亚甲蓝，天青B等）作对比染色，形成红蓝分明、色泽艳丽的结果，因为伊红具较强的扩散吸附染色特性。酸性偶氮类染料有橙黄G（orange G）、刚果红（congo red）、亮藏花精（brilliant crocein）等。由于酸性染料是阴离子型染料，因此它们与细胞中的碱性成分结合并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分及胞浆中的一些蛋白质。
除上述酸性和碱性染料外，有的还将在同一条件下既具阴离子型又有阳离子型的染色剂称复合染料，如瑞氏染色剂、姬姆萨染色剂等。
（二）染色原理
细胞着色的原理至今虽无满意的解释，但多数学者认为是物理作用和化学作用综合的结果。
1、物理作用
包括毛细管现象和渗透、吸收、吸附作用等。通过这些因素，染料的色素粒子就能顺利地进入组织、细胞并与其牢固结合而着色。
瑞氏染色法
Wrfeht和Giemsa都于1902年报告了各自的新的血液学染色剂，其主要特点是在制备多色性亚甲蓝（主要指天青B）方面做了改进，使血细胞和疟原虫着色较好，操作简便。
上述染色法均是含伊红和亚甲基蓝衍生物的复合染料。在临床检验工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物和排泄物涂片中各种细胞的染色，有利于在显微镜下观察细胞形态及对细胞进行分类检查。
【染色原理】
瑞氏染色分两相进行，第一相是酸性染料伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒等结合；碱性染料天青B与细胞中的酸性物质如核染色质（chro－matin）、特异中性颗粒、血小板及富含核蛋白的胞质结合。第二相是天青B和伊红在适宜条件下形成紫色的天青B一伊红复合物（azure B－eosin complex），这种复合物是形成Romanowsky－Giemsa效应的基础。
Romanowsky－Giemsa效应包括：①白细胞核染色质染成紫色，疟原虫的染色质染成红色；②中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区染成紫色；③产生本效应必须有两种染料参与，一种是天青B，另一种是伊红。
Wittekind（1985）指出，天青B与DNA分子中的磷酸基结合，而伊红既与DNA分子中的阳离子部位结合，又与天青B结合，与天青B的结合力来源于电子供一受体的电子转移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）与伊红分子中的叛基（－COOH）间形成氢键。因此，天青B是噻嗪类染料中能与伊红形成复合物的最佳选择，因为拥有四个甲基侧链的亚甲蓝不能以氢键与伊红结合。
甲醇除作为染料的溶剂，能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负电荷伊红外，因其具有脱水力，还可将细胞固定为一定形态，并使蛋白沉淀为颗粒状、网状结构，增加细胞与染料的接触表面，增强染色效果。
细胞中的各种有机物质（特别是蛋白质）、染料等对环境的州值非常敏感。如环境偏酸，氢离子增多，降低对碱性染料的亲和力；增强伊红着色，出现异常红染；相反，则可出现异常蓝染。最佳环境应维持在PH值6 4～6、8。因此，必须使用缓冲溶液。
【试剂】
1、Wright染液瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml。
将瑞氏染料放入清洁干燥乳钵里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完为止。或将瑞氏染粉和甲醇直接置于棕色瓶中，加碎玻璃适量，立即用力振荡smin，置室温中，连续3天，每天振摇2～3次，促其溶解。配好后放室温，一周后即可使用。新配染液效果差，放置时间越长天青B越多，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸，甲醇需用AR级。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇过早挥发外，并可使细胞着色清晰。
1、磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.4～6.8）
磷酸二氢钾（无水）0.3g；
磷酸氢二钠（无水）0.2g；
蒸馏水加至1000ml。
配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。
【染色方法】
（1）用蜡笔在血膜两头划线，然后将血片平放在染色架上；
（2）加瑞氏染液数滴，覆盖整个血膜，固定细胞约lmin；
（3）滴加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，染色5～10min；
（4）用清水冲去染液，待干后镜检。
【染色结果】在正常情况下，血膜外观染成淡紫红色。显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感；白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。
染色偏酸，则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。染色偏碱，则所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色，甚至紫黑或蓝色。中性颗粒偏粗、偏碱，染成紫黑色，血膜厚的部位呈绿色。
【注意事项】
1、未干透血膜的不能立即染色，否则染色时易脱落。
2、染色时间，与染液浓度、室温及细胞多少有关。梁液淡、室温低、细胞多，则染色时间长；反之则可减少染色时间。染液浓淡及染色时间长短要摸索，特别是更换染液时更应如此。
3、染液不能过少，以防蒸发沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，则不易冲掉。
4、冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防染料沉着在血膜上。冲洗染料时间不能过长，以防脱色。冲洗完的血片应立放于架上，防止剩余水分浸泡脱色。
5、如血膜上有染料颗粒沉积，可用甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。
6、染色过谈，可以复染，复架时应先加缓冲液，创造良好染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。
7、染色过深可用水冲洗或浸泡一定时间，也可用甲醇脱色。
8、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。

白细胞计数的误差因素分析
①技术误差：器材、标本要求、加盖玻片影响、冲池影响、计数原则（记上不计下，记左不记右）、计数室内细胞分布要均匀、有核红细胞影响。②固有误差：主要指记数域误差。还包括计数池误差和吸管误差。③生理状态影响：运动、劳动、冷水浴、酷热、严寒等出现一过性白细胞增高。
1.技术误差,可通过规范、熟练的操作,仪器的校正、试剂的标准化和操作人员责任心的增强而减小或消除(器材,标本要求,加盖玻片影响,充池影响,计数原则,细胞分布要均匀,有核红细胞影响);
2.固有误差,主要指计数域误差,即由于每次充池后血细胞在计数室内分布不可能完全相同所造成的误差,属于偶然误差.3.生理状态影响:运动,劳动冷热水浴,酷热,严寒等常出现一过性白细胞增高;一日之内白细胞数最高与最低可差1倍;吸烟者比非吸烟者高30%.

血细胞分析仪的最新发展
血细胞分析仪的发展已有50年历史了，国内医院应用血细胞分析仪的情况也越来越普及。近年来由于综合性高科技的飞速发展，血细胞分析仪上也不断采用了最新的电子、光学、化学和计算机技术，从而不断满足临床工作对血液细胞分析的要求。提供更加方便适用、更多功能和参数、更加准确、更快速度的血细胞分析仪，已经是各血细胞分析仪生产厂商的目标。
一血细胞分析仪近年来的发展变化
1.血常规检验多参数化
近年来许多血细胞分析仪器都在增加新的参数以满足临床在诊断和鉴别诊断方面的需求。最初的血细胞计数仪(Cell Counter)仅仅能够计数红细胞(RBC)和白细胞(WBC)，后来又有了血红蛋白(HBG)、血小板(PLT)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)等几个参数。而发展成为血细胞分析仪(Hematology Analyzer)后，又增加了许多分析和计算参数。最早加入到并得到公认的参数是红细胞体积分布宽度(RDW)，目前该参数已经成为许多型号血细胞分析仪的标准参数，在各种贫血的诊断和治疗中起着重要作用，而该参数是很难应用人工方法测定的。随后有关平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、大血小板比率、白细胞三分群、白细胞五分类、血红蛋白浓度分布宽度、异常淋巴细胞提示、幼稚细胞提示等各种参数和功能也不断的添加到一些品牌的仪器上，目前有的仪器甚至可以提供40~50种测量或计算参数。但很多的新参数目前仍不能应用于临床，仅限定在实验室中供研究使用。在美国凡进入临床应用的新的实验参数，需要经过FDA(美国食品和药品管理局)的批准认可，其批准原则是经过多年实验认证，该参数应该是对临床诊断有用的、安全的和高效率的。这个认证是非常严格的，而在我国目前还缺乏这样严格的认证和批准体系。
2.多功能合成扩展
血细胞分析仪已经不仅仅局限在进行常规血细胞分析，近年来它增加了许多扩展的功能。例如将网织红细胞(RET)的计数和分析功能加入其中，例如Bayer ADVIA 120型;Sysmex SE-9000/SE-9500/XE-2100型;Coulter MAXM/STKS/HmX/GEN.S型;Abbott CELL-DYN3200/3500R/4000型等。一些仪器另外增加了幼稚细胞分析和有核红细胞分析功能，甚至对血液细胞中的某些寄生虫进行提示，例如Sysmex SF-3000/SE-9000/SE-9500/XE-2100;Bayer ADVIA 120;Abbott CELL-DYN3500/4000;Coulter HmX/LH750/GEN.S System 2型等。更有一些仪器把流式细胞分析仪的某些功能合并到血细胞分析仪上，这样在进行常规血细胞分析时就可以得到某些淋巴细胞亚群的分析结果，例如在Coulter STKS上可以同时测定CD4和CD8，在Abbott CELL-DYN 4000上可以测定CD3、CD4、CD8和CD61，使得一机两用。
3.检测速度的提高
许多仪器由于增加了自动进样系统，测定速度加快，一般可以达到每小时80~100个样品，在不包含网织细胞检测的情况下，Coulter GEN.S System 2型每小时测定105个标本;Bayer ADVIA 120每小时120个标本;而Sysmex KX-2100可以达到每小时150个标本。这些仪器都可以在自动成批进样的同时，随时插入急诊检验的标本。
4.方法的改进和进展
为了做到更加准确的计数和分析、更多的测定和分析参数，血细胞测定和分析的方法已经不局限于某一种单一的方法，如传统的电阻抗法或后来应用的激光散射法，还加了多项技术的相互联合应用。例如在白细胞分类上，各厂家分别采用了不同的方法，Coutler采用了VCS技术，即体积测量、射频高频传导性和激光散射技术;Sysmex则采用了直流电阻抗(DC)与射频(RF)和特殊细胞染色技术;Bayer公司的ADVIA120则采用激光散射和细胞化学(过氧化酶和嗜碱细胞染色)技术;而Abbott是采用多角度偏振光散射(MAPSS)技术对白细胞进行分析。除了在白细胞分类上采用多种处理方法外，在红细胞和血小板分析上也采用了光学和电阻法结合的处理方法，以期得到更正确的结果;对红细胞体积进行三维空间分析(3D)，体积大小和色素含量的分析;对血红蛋白测定不仅使用比色法，同时还使用激光散射法进行单个红细胞血红蛋白量的分析，以尽量减少高WBC、乳糜血、高胆红素等对HBG比色的影响。由于方法的改进，这些仪器已经不仅仅采用2~3种试剂来完成测定工作，常常是6种以上的试剂联合使用，才能够适应方法的要求，例如Bayer ADVIA120型需要多达11种试剂，而这些试剂由于技术含量较高，专用性强，各厂家产品之间不能混用，生产技术要求高，因此国内还没有替代产品出现。
5.应用的方便性
对于操作者来说，仪器最大的优越性还应该体现在操作的方便性和灵活性上。许多厂家都考虑到了这一点。例如可以使用静脉或末稍血液;可以在标本量很大的情况下选择全自动进样系统，也可使用单独闭盖或开盖取样系统(闭盖全自动进样或单独进样对操作者是非常安全的操作方式);对项目可作适当的组合，以适应临床及患者的需求，例如操作者可以选择CBC方式(仅含细胞计数、不分类)、CBC+DIFF方式(计数加分类)、RET方式，可将它们任意单选或组合;条码的应用给标本编号提供了方便，仪器通过自动扫描条码，来鉴别标本的来源、需要检测的项目和区分患者，最后根据条码提供的信息将结果返回到临床或病人档案中，为检验数据的电子化提供了极大方便，也减少了编号带来的差错。上述的许多功能已经在许多新型的高级五分类式血细胞分析仪中得到实现。
二血细胞分析仪产品的系列化和流水线化
1.产品的系列化
各有实力的公司不断开发系列化产品以满足不同类型用户的需要。例如Coulter公司的ACT系列仪器，有最简单的ACT 8型只有8个参数到12参数，到也有18参数三分类的ACT DIFF，亦有5分类的ACT 5-DIFF，甚至还有可增加动物血液分析的型号。Sysmex的多种系列化仪器如SE系列、K系列、F系列等在我国也很常见。此外Abbott、ABX、日本光电、Swelab等公司都有各种系列化仪器不断推出，以满足各种需求。
2.流水线化
在全自动血液分析仪器的基础上实现全自动流水线化，是血液分析的又一大飞跃，但这需要雄厚的资金支持。所谓流水线化即是将血液常规分析中的所有步骤和项目进行系统性联合，将血液常规分析、网织红细胞分析、血片的制备(选择、涂片、编号、染色、干燥)等系列步骤通过仪器自动完成。这种流水线可以将具有不同功能的单个设备用自动传送系统连接在一起，例如Sysmex的HST型小型流水线血液分析仪(图1)将电脑控制终端、SE-9000血细胞分析仪、R-3000网织细胞分析仪、SP-100血片涂片机连结在一起，使血液标本从计数开始自动按程序运行到推片和染色结束，全部自动进行。而现在许多仪器已经合并了网织红细胞分析功能，因此只有电脑控制台、血液分析仪主机、涂片染片机，如Coulter LH700系列(图2)。近年来Abbott、ABX都有类似小型血细胞分析流水线系统推出(图3)。
流水线系统的优势在于极大地减少了人工劳动的强度，加快了标本的处理速度，同时使得许多操作更加标准化和减少了操作者之间的个体差异。例如制作血涂片的过程可以根据仪器测定的红细胞参数和设定条件来智能化地决定该患者血涂片的制作要求，如果细胞数量少，涂片机会调整制片的角度，制作较厚的血涂片，细胞数量较多则选择制作比较薄的血涂片，这样可以更方便阅片医师的显微镜检查工作。染色条件由于设定非常精确，因此染色效果非常一致，颜色和效果可以满足临床阅片的要求。
流水线系统最为重要的部分是计算机控制系统，因为整个流程是在它的控制下运行的，而系统中的“规则”是非常重要的一个软件环节。所谓规则就是来自仪器和专家经验的综合，这些“规则”将被存储在计算机内，凡不符合规则的标本将被筛选出来。例如白细胞计数高于或低于多少，直方图或散点图那个区域出现异常信号，则该标本应该被制作涂片，需要进行显微镜检查;那个标本的红细胞或血红蛋白低于多少、直方图或散点图有何改变，该标本需要自动进行网织红细胞分析和涂片检查等。这些规则需要来自很多经验的积累和各方面专家的意见。笔者最近了解到Coulter LH系列的规则(Rule Systems)可达到85项，凡通过规则的标本可以不需要显微镜检查，这样的标本占70%以上，而未通过规