细胞培养基本技术专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养基本技术,Bin Lu,Ph.D.,细胞培养基本技术,第1页,www.nobelprize.org/,Thomas C.Sdhof,Randy W.Schekman,James E.Rothman,Born:3 November 1950,Haverhill,MA,USA,Born:30 December 1948,St.Paul,MN,USA,Born:22 December 1955,Goettingen,Germany,Stanford University,Stanford,CA,USA,University of California,Berkeley,CA,USA,Yale University,New Haven,CT,USA,细胞培养基本技术,第2页,Prize motivation:for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic,a major transport system in our cells,细胞培养基本技术,第3页,1665,年英国学者,Robert Hooke,，用自制显微镜观察软木薄片，第一次发觉植物细胞结构，并首次借用拉丁文,Cella,（小室）词,.,1983-39,德国植物学家施莱登和动物学家施旺,确立了,“,细胞学说,”,基本标准。,（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来；,（）每个细胞都作为一个相正确独立单位，有自己,“,生命,”,。,（）新细胞能够经过老细胞繁殖产生。,进化论，遗传学和,细胞学说,定为当代生物学三大基,石，而细胞学说又是前二者,基石,。,细胞培养基本技术,第4页,The,cell,is the basic structural and functional unit of all known living,organisms,.It is the smallest unit of life that is classified as a living thing,and is often called the building block of life.Organisms can be classified as,unicellular,(consisting of a single cell;including most,bacteria,)or,multicellular,(including,plants,and,animals,).Humans contain about 10,trillion,(10 )cells.Most plant and animal cells are between 1 and 100,m and therefore are visible only under the microscope.,13,细胞培养基本技术,第5页,主要内容,一、细胞培养,基本概念,二、细胞培养,基本条件,三、细胞培养,用液配制,四、细胞培养,基本方法,五、培养,细胞活力测定,六、细胞,冻存和复苏,七、细胞培养,污染和检测,细胞培养基本技术,第6页,是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外,模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，,使之生存和生长，并维持其结构和功效特征。,一、细胞培养基本概念,细胞培养,(cell culture),：,把活体一小片组织（,O.5,1,立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。,组织培养,(Tissue culture),：,器官培养,(Organ culture),：,将活体中整个器官或一部分器官取出，置于生长并同时保持其一定结构和功效特征。,细胞培养基本技术,第7页,细胞培养基本概念,原代培养,取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长细胞在传代,之前称为原代培养。,优点,组织细胞刚脱离机体，生物性状还未发生较大改变，在一定程度上能够反应体内状态。,细胞培养基本技术,第8页,传代,原代培养细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，因为空间不足或细胞密度过大，造成营养枯竭，会影响细胞生长，所以需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新培养器皿中。,细胞培养基本技术,第9页,Surface Area(mm,2,),Seeding Density,Cells at Confluency,1,Versene(ml of 0.05%EDTA),Trypsin(ml of 0.05%tryspin,EDTA,),Growth Medium(ml),Dishes,35 mm,962,0.3 x 10,6,1.2 x 10,6,1,1,2,60 mm,2,827,0.8 x 10,6,3.2 x 10,6,3,2,3,100 mm,7,854,2.2 x 10,6,8.8 x 10,6,5,3,10,150 mm,17,671,5.0 x 10,6,20.0 x 10,6,10,8,20,Culture Plates,6-well,962,0.3 x 10,6,1.2 x 10,6,2,2,3-5,12-well,401,0.1 x 10,6,0.4 x 10,6,1,1,1-2,24-well,200,0.05 x 10,6,0.2 x 10,6,0.5,0.5,0.5-1.0,Flasks,T-25,2,500,0.7 x 10,6,2.8 x 10,6,3,3,3-5,T-75,7,500,2.1 x 10,6,8.4 x 10,6,5,5,8-15,T-160,16,000,4.6 x 10,6,18.4 x 10,6,10,10,15-30,Useful Numbers for Cell Culture,There are various sizes of dishes and flasks used for cell culture.Some useful numbers such as surface area and volumes of dissociation solutions are given below for various size culture vessels.,1,The number of cells on a confluent plate,dish,or flask will vary with cell type.,For this table,HeLa cells were used.,细胞培养基本技术,第10页,Mammalian Cells plating,Corning tech(800)492-1110 X2269,6 well plate 2.6 x 10,5,cells/well,24 well plate5.4 x 10,4,cell/well,100 mm dish 1.5 x 10,6,cells/dish,150 mm dish4.5 x 10,6,cells/dish,150 cm,2,flask8x 10,6,cells=80-90%confluent,细胞培养基本技术,第11页,传代注意事项,接种数量为,510,810,个,/ml,。,传代密度太低，细胞轻易死亡，表现出细胞在达,到增加前有较长滞留期。,培养液因为,pH,下降而展现黄色，表明细胞已经达,到最大密度需要换液或进行传代培养。,假如是单层贴壁细胞，等长满培养瓶表面，即,可进行传代。,4,5,细胞培养基本技术,第12页,原代培养细胞生命归宿,1.原代培养期,2.传代期,3.衰退期,细胞培养基本技术,第13页,细胞培养基本技术,第14页,细胞系,（cell line）：传代培养细胞是细胞系(原代培养物经首次传代成功后即成细胞系)。,有限细胞系,（finite cell line)，,无限细胞系,(infinite cell line),细胞系（,cell line,）,肿瘤细胞系多由瘤建成，多呈类上皮型细胞，含有不死性和异体接种致瘤性。,细胞培养基本技术,第15页,细胞株（,cell strain,）,由含有一些特征与标志细胞，经选择或克隆,化而派生亚系，这些特征或标志在后续培,养中一直保持下去细胞群。,再由原细胞株深入分离培养出与原株性状不,同细胞群，亦可称之为亚株。,细胞培养基本技术,第16页,细胞系或细胞株命名,以供体患者姓名命名：,HeLa,（起源于宫颈癌）,以时间地点来命名：,CHO,中国仓鼠卵巢细胞（,Chinese Hamster Ovary,）,宫,-743,：宫颈癌上皮细胞，,1974,年,3,月建立,NIH3T3,：美国国立卫生研究院（,National Institute of Health,）建立，,每,3,天传代，每次接种,310,5,细胞,ml,以组织起源命名：,如,BHK(,幼地鼠肾细胞,),以临床疾病类型命名：,如,BALL-1,细胞系,(,来自,B,淋巴细胞急性白血病人白细胞,),细胞培养基本技术,第17页,二、细胞培养基本条件,无菌条件,细胞生长条件,细胞检测条件,细胞保留条件,试验室安全,细胞培养基本技术,第18页,细胞培养无菌环境,无菌室结构：普通由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。,（使用前）紫外照射（,15-30,分钟）,每七天甲醛熏蒸（,2,小时）和每个月新洁尔灭擦拭地面一次方式进行消毒,细胞培养基本技术,第19页,细胞培养基本技术,第20页,超净工作台,超净工作台工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气渐渐经过工作台面，使工作台内组成无菌环境。,细胞培养基本技术,第21页,超净工作台使用,使用前,开启柜内紫外灯照射,10,30,分钟；,预工作,10,15,分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态。,使用完成后,要用,70%,酒精将台面和台内四面擦拭洁净。,细胞培养基本技术,第22页,火焰消毒,在无菌环境进行培养时，首先关键点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,培养瓶,滴管、试管、吸管,细胞培养基本技术,第23页,惯用培养器皿清洗及消毒,玻璃器皿清洗,普通经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（,24,小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后,50,烘干。,新橡胶制品洗涤方法,0.5M NaOH,煮沸,15,分钟，流水冲洗，,0.5M HCl,煮沸,15,分钟，流水冲洗，自来水煮沸,2,次，蒸馏水煮沸,20,分钟，,50,烤干备用。,细胞培养基本技术,第24页,*,清洁液配制,细胞培养基本技术,第25页,消毒,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，,15,磅，维持,20-30,分钟。,消毒前惯用包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒,电热干燥箱：干热消毒，,160,180,，维持,2,小时。,主要用于玻璃器皿消毒。,细胞培养基本技术,第26页,细胞培养试验用具,细胞培养瓶,(Flask),25,平方厘米（,T25),75,平方厘米,(T75),150,平方厘米,(T150),细胞培养基本技术,第27页,细胞培养板,(Plate),6,孔,12,孔,24,孔,48,孔,96,孔,细胞培养基本技术,第28页,细胞培养皿,(Dish),35 mm,60 mm,100 mm,150 mm,细胞培养基本技术,第29页,冻存管,Cryo Vial,1.2ml,2ml,5ml,细胞培养基本技术,第30页,离心管,15ml,50ml,细胞刮,细胞培养基本技术,第31页,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采取滤过法除菌。,安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝上，不然起不到过滤作用。,细胞培养基本技术,第32页,细胞培养基本技术,第33页,CO2培养箱,CO2,培养箱设定条件为,37,，,5,CO,2,。,使用,CO2,培养箱培养细胞时应注意问题：,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微,松，以确保通气。,保持培养箱内空气洁净。定时消毒。,箱内灭菌蒸馏水,3000,毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,细胞培养基本技术,第34页,培养细胞观察,细胞培养基本技术,第35页,液氮罐,细胞培养基本技术,第36页,细胞培养基本技术,第37页,何处购置细胞,ATCC,细胞库,(,www.atcc.org,).,美国菌种保藏中心又称美国模式菌种搜集中心。,当前它能够提供以下物品,细胞系,3000,种,细菌和噬菌体,15000,种,动植物病毒,2500,种,原生动物,1200,种以及重组物品,欧洲动物细胞库,(ECACC),和日本细胞库,(RCB),细胞培养基本技术,第38页,国内细胞库,中国科学院细胞库,中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,中国经典培养物保藏中心,也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定专利培养物,/,生物材料菌种保藏机构。,37,O,2,CO,2,:5%CO,2,+H,2,O H,2,CO,3,H,+,+HCO3,-,pH:,7.2-7.4,渗透压,3,无污染,4,无毒,细胞培养基本技术,第40页,细胞营养,碳水化合物、氨基酸和脂类三大类,也需要一定量无机盐、维生素和微量元素,细胞培养基本技术,第41页,细胞培养惯用液体,水,平衡盐溶液,pH,调整液,消化液,抗生素溶液,培养基,细胞培养基本技术,第42页,三、细胞培养用液配制,水：新鲜三蒸水或去离子水,平衡盐溶液,主要由无机盐和葡萄糖配制而成,作用：维持渗透压、缓冲和调整酸碱度,惯用缓冲液：,生理盐水,PBS,Hanks,液,（,D-Hanks,惯用于配制胰酶溶液）,细胞培养基本技术,第43页,平衡盐溶液：无,Ca,2+,、,Mg,2+,缓冲液,PBS,：,NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na,2,HPO,4,.H,2,O 1.56 g,KH,2,PO,4,0.20,加水至,1000 ml,D-Hanks,液,细胞培养基本技术,第44页,pH,调整液,碳酸氢钠液,HEPES,缓冲液,是一个氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定,pH,范围。,通常使用浓度为,10,15,mM,，普通培养液内含,20mmol/LHEPES,即可到达缓冲能力。,细胞培养基本技术,第45页,消化液,胰蛋白酶溶液,EDTA,溶液,胶原酶溶液,细胞培养基本技术,第46页,胰蛋白酶溶液,主要作用：,水解与赖氨酸或精氨酸相连接肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。,惯用浓度：,0.25%,用无,Ca2+,、,Mg2+,PBS,缓冲液或,D-Hanks,配制，用滤器过滤除菌。,消化时间：,2-10,分钟（显微镜下观察）,用含血清培养液终止其对细胞消化作用,。,细胞培养基本技术,第47页,EDTA,溶液,作用机制：,经过结合（螯合）细胞间质中二价阳离子，从而破坏细胞间连接。,使用浓度,：,0.02%，配制时应加碱助溶,。,EDTA,不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或,PBS,彻底冲洗培养瓶。,细胞培养基本技术,第48页,胶原酶溶液,主要作用,水解结缔组织中胶原蛋白成份，而对上皮细胞影响不大。,惯用剂量：,最终浓度,200U/ml,（约为,1mg/mL,）或,0.03%0.3%,，可用,D-hanks,、,PBS,或含血清培养液配制。,分型：,分,、,、,、,、,型以及肝细胞专用胶原酶，依据,所要分离消化组织类型选择胶原酶类型（价格贵）。,细胞培养基本技术,第49页,胰蛋白酶和胶原酶生物活性差异,项目 胰蛋白酶 胶原酶,消化特征 消化软组织 消化纤维多组织,用量,0.01%0.5%0.10.3,mg/mL,（,200 U/mL,）,消化时间,0.5 2h 1 12h,pH 89 6.57.0,作用强度 强烈 缓解,细胞影响 时间过长有影响 无大影响,血清抑活 有 无,Ca2+,和,Mg2+,有影响 无影响,细胞培养基本技术,第50页,抗生素溶液,通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称,“,双抗溶液,”,。,配制,详细操作均在超净台内完成。青霉素是,80,万,U,/,瓶，用注射器加,4ml,灭菌双蒸水。链霉素是,100,万,U,/,瓶，加,5,ml,灭菌双蒸水，即每毫升各为,20,万,U,。,使用时溶入培养液中，使青、链霉素浓度最终为,100,U/ml,。,庆大霉素：使用终浓度为,100,U/ml,，广谱、稳定。,细胞培养基本技术,第51页,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长溶液，分,天然培养基,和,合成培养基,。,天然培养基,：,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,优点：,营养成份丰富，培养效果好,缺点：,起源受限。成份复杂，,影响对一些试验产物提取和试验结果分析,。易发生支原体污染,细胞培养基本技术,第52页,合成培养基,依据细胞生存所需物质种类和数量，用人工方法模拟合成。,包含四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物,当前惯用培养基：,RPMI-1640,、,DMEM,、,TC199,、,M199,、,MEM,另有没有血清培养基、无蛋白培养基,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量天然培养基（如血清）。,优点：,标准化生产，组分和含量相对固定。成本低,缺点：,缺乏一些成份，不能完全满足体外细胞生长需要。,细胞培养基本技术,第53页,RPMI1640,最初是由,G.E,，,Moore,为培养小鼠白血病细胞而设计。,开始配方尤其适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经过改良，从,RPMI1630,、,RPMI1634,、直至,RPMI1640,。,其组分较为简单，适合许各种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。,尤其适合人白细胞，如,H9,、,T-15,、,HL-60,、,IM-9,和,K-562,等细胞系培养。,细胞培养基本技术,第54页,RPMI,1640,种类,RPMI,1640,（,A,）,（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）,RPMI,1640,（含谷氨酰胺、过滤灭菌）,细胞培养基本技术,第55页,DMEM,细胞培养基,是在,MEM,培养基基础上研制,与,MEM,比较增加了各种成份用量，同时又分为高糖型（,4500g/L,）和低糖型,(1000g/L),。,高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。,DMEM,（,A,）,【,不含谷氨酰胺、可高压灭菌,】,DMEM,（,H,）,【,含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌,】,DMEM,（,L,）,【,含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌,】,细胞培养基本技术,第56页,血清使用,血清质量好坏是试验成败关键,惯用血清,胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、,马血清等，胎牛血清是品质最高。,优质血清标准,透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、,病毒污染。,血清灭活（消除补体活性）,56,，,30,分钟。,血清消毒：过滤除菌,细胞培养基本技术,第57页,牛血清,胎牛血清应取自剖腹产胎牛,新生牛血清取自出生,24,小时之内新生牛,小牛血清取自出生,10,30,天小牛,使用浓度：,普通为,5,20,，最惯用是,10,。,细胞培养基本技术,第58页,何谓,FBS,、,FCS,、,CS,、,HS,?,FBS(fetal bovine serum),和,FCS(fetal calf serum),是相同意思，二者都是指胎牛血清，,FCS,乃错误使用字眼，请不要再使用。,CS(calf serum),是指小牛血清,HS(horse serum),是指马血清,细胞培养基本技术,第59页,胎牛血清（,Fetal Bovine Serum,FBS,）,:,屠宰怀孕母牛时候,经过心脏穿刺采血获取胎牛血清，新生牛（小牛）血清（,Calf serum,CS,）则采自出生,10,至,14,天小牛。,二者所含促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其它活性物质等组份与百分比不一样。用途与使用方法也有所区分，比如一些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可。普通来说，胎牛血清是品质最高，因为胎牛还未接触外界，血清中所含抗体、补体等对细胞有害成份最好。除了用于细胞培养外，这些牛血清还可用于封闭液、保护液和缓冲液等。,细胞培养基本技术,第60页,血清解冻步骤,逐步解冻法,30,或,80,至,4,冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，普通用,50 ml,无菌离心管可分装,40,45 ml,。,勿直接,由,30,至,37,解冻，因温度改变太大，轻易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,细胞培养基本技术,第61页,无机盐,CaCl,2,、,KCl,、,MgSO,4,、,NaCl,、,NaHCO,3,、,NaH,2,PO,4,对调整细胞渗透压、一些酶活性及溶液酸碱度都是必须。,细胞培养基本技术,第62页,谷氨酰胺,细胞需要,谷氨酰胺,合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要造成细胞生长不良甚至死亡。,普通培养液中谷氨酰胺含量为,1,4mmol/L,。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，,4,放置,1,周可分解,50,，故应单独配制，置于,-20,保留，临用前加入培养液。,配制方法：谷氨酰胺,2.922g,溶于三蒸水加至,100ml,即配成,200mmol/L,溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，,-20,保留，使用时可向,100ml,培养液中加入,1ml,谷氨酰胺溶液。,谷氨酰胺双肽，如甘氨酰基谷氨酰胺。这种谷氨酰胺在溶液中稳定，并可与谷氨酰胺一样有效地被细胞利用。,细胞培养基本技术,第63页,水：新鲜配置三蒸水或去离子水,平衡盐溶液：无Ca,2+,、Mg,2+,缓冲液,PBS：NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na,2,HPO,4,.H,2,O 1.56 g,KH,2,PO,4,0.20,加新鲜配置三蒸水或去离子水,至1000 ml,细胞培养用液配制,细胞培养基本技术,第64页,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量天然培养基（如血清）。,细胞培养基本技术,第65页,血清中含有：,各种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）,各种金属离子；,激素；,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。,各种生长因子,转移蛋白,不明成份,(like UFO),细胞培养基本技术,第66页,完全培养基组成,基础培养基 80一95,血清 5一20,碳酸氢钠 2.0 g/L,青、链霉素 各100卑位毫升,细胞培养基本技术,第67页,普通说来含5小牛血清培养基对大多数细胞能够维持细胞不死但支持细胞生长普通需加 10血清,对于血清支持细因生长生物学效应已得到证实，但对血清中复杂成份至今还未完全清楚,血清中不但存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，所以在含血清培养基中培养细胞所反应生物学特征是细胞和复杂血清因子综合反应。,在生长因子、蛋白质工程、基因表示调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,细胞培养基本技术,第68页,培养细胞生长方式及类型,贴附生长型,细胞,必须贴附于底物才能生长细胞。从形态上大致分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态细胞。,悬浮生长型,细胞,不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。,见于各种造血系统肿瘤细胞,四、细胞培养基本方法,细胞培养基本技术,第69页,细胞贴附过程,贴附生长型细胞,+,+,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,细胞培养基本技术,第70页,上皮样细胞,起源：,起源于外胚层,，内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：,类似,体内,上皮细胞,扁平,，,不规则多角形,，中有圆形核,细胞培养基本技术,第71页,生长特点,易相连,成片,相靠,紧密相连,成薄层,铺石状,生长,时呈,膜状,移动,极少,脱离细胞群而,单个活动,上皮型细胞,细胞培养基本技术,第72页,SKOv3,（卵巢癌细胞,）,1.,细胞种类：,SKOv3,（卵巢癌细胞）,2.,培养天数：传代后,3d,；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X10,；,4.,培养基种类：,DMEM+5%,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞贴壁生,长，生长速度较快。,CCL-149,1.,细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；,2.,培养天数：,1d,（种在,48,孔板中）；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,F12K+10%,胎牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，,3,4,天传代一次，,Giemsa,染色。,细胞培养基本技术,第73页,成纤维细胞样细胞,起源：由,中胚层间充质组织起源,组织,如：真正成纤维细胞,心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞,形态：,似体内成纤维细胞,形态,胞体梭形,或不规则三角形,胞质向外伸出,2,3,个,长短不等突起,中有卵圆形核,细胞培养基本技术,第74页,生长特点,排列成,放射状,，漩涡状,并不紧靠连成片,，,细胞,细胞接触易断开而,单独行动,游离,单独,成纤维样细胞，常有几个,伸长细胞突起,细胞培养基本技术,第75页,HUVECs,人脐静脉内皮细胞,1.,细胞种类：人脐静脉内皮细胞；,2.,培养天数：,4d,；原代培养；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,M199+15,胎牛,血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈梭,形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞,1.,细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；,2.,培养天数：,7,天；,3.,放大倍数：,200,倍，倒置显微镜；,4.,培养基种类：,DF12+10,FBS,；,5.,细胞状态与特征简述：使用,percoll,密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液,48h,，这是,7,天后骨髓间充质干细胞扩增情况。,细胞培养基本技术,第76页,每代贴壁细胞生长过程,游离期,贴壁期,潜伏期,对数生长久,停顿期（平台期）,细胞培养基本技术,第77页,游离期,细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。,吸附期,贴附底物，普通24小时内贴壁。,潜伏期,此时细胞有生长活动，基本无增殖。,细胞株潜伏期普通为624小时。,对数生长久,细胞数随时间改变成倍增加，活力最正确，最适合进行试验研究。,停顿期（平台期）,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。,机制：接触抑制、密度依赖性,细胞培养基本技术,第78页,密度抑制（,Density inhibition,）或接触抑制（,Ccontact inhibition,）,1958,年,Abercrombie,等学者提出一个现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时一些细胞可移向其它方向，确保细胞不会重合，一但接触，这种活动即可停顿。,所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触表面区域也对应降低，营养成份消耗，其分裂也将停顿。,细胞培养基本技术,第79页,悬浮生长型细胞,起源：,血，,脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞,特点：,在悬浮中生长良好细胞，圆形,优点：,生存空间大，提供数量大，,传代方便，易于收获，可获,得稳定状态,缺点：,观察不方便，很多细胞不能,悬浮生长,(,尤以正常细胞,),细胞培养基本技术,第80页,KU812,1.,细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；,2.,培养天数：,5d,；,3.,放大倍速：倒置显微镜,X20,；,4.,培养基种类：,RPMI1640+10%,新生牛血清；,5.,细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,细胞培养基本技术,第81页,K562,细胞,1.,细胞种类：,K562,（人慢性红白血病细胞株）；,2.,培养天数：传代后,2,天；,3.,放大倍数：倒置显微镜,X10,；,4.,培养基种类：,RPMI1640+10%,胎牛血清，,4mM Glutamine,；,5.,细胞状态与特征介绍：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,细胞培养基本技术,第82页,1,悬浮生长细胞传代,细胞传代方法,直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉,1/2 1/3,，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。,离心法：离心,800 1000rpm,，,5min,，除上清，加新培养液，然后传代接种。,部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代,细胞培养基本技术,第83页,直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉,1/2 1/3,，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。,离心法：离心,800 1000rpm,，,5min,，除上清，加新培养液，然后传代接种。,部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代,细胞培养基本技术,第84页,吸除瓶内旧培养液；加入,1ml,消化液；,37C,或室温,25 C,消化2 5分钟,显微镜下进行观察，发觉胞质回缩、细胞间隙增大后；,直接加少许含血清培养液，终止消化；,细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新培养瓶内。,2,贴壁生长细胞传代,采取酶消化法传代。,惯用消化液是,0.25,胰蛋白酶液。,细胞培养基本技术,第85页,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代,原代培养贴壁细胞需控制消化时间,吹打已消化细胞应降低机械损伤,首次传代时细胞接种数量要多一些,首次传代培养,pH,应偏低些,小牛血清浓度可加大至,15%,20%,左右,细胞培养基本技术,第86页,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示,细胞计数原理和方法与血细胞计数相同,血细胞计数器：手工计数细胞,Coulter,计数仪：人工计数,细胞培养基本技术,第87页,细胞计数步骤,1,、将血球计数板及盖片擦拭洁净，并将盖片盖在计数板上。,2,、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,3,、静置,3,分钟。,4,、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。,细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/410,4,注意,：压线细胞只计,左侧,和,上方,。,镜下偶见由两个以上细胞组成细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,细胞培养基本技术,第88页,细胞培养基本技术,第89页,细胞培养基本技术,第90页,五、培养细胞活力测定,细胞活力：,总细胞中活细胞所占百分比。,由组织中分离细胞普通也要检验活力，以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。,复苏后细胞也要检验活力，了解冻存和复苏效果。,细胞培养基本技术,第91页,测定方法,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。,流式细胞仪,细胞活性指标通常包含细胞膜对核酸染料通透性，代谢活性，膜电位等。,细胞培养基本技术,第92页,四唑盐（,MTT,）比色法,MTT,比色法原理：,活细胞,中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水,蓝紫色,产物甲臢（,forma,za,n),，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功效。,二甲亚砜（,DMSO,）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含,formazan,量成正比。,甲臢染料在,A570nm,处产生吸收值，用酶标仪测定,A,值。,细胞培养基本技术,第93页,六、细胞冻存和复苏,细胞深低温保留基本原理是：,在,80,以下时，细胞内酶活性均己停顿，即代谢处于完全停顿状态，故能够长久保留。,细胞低温保留关键：,在于经过,0-20,阶段处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞严重损伤。,细胞培养基本技术,第94页,冻存和复苏标准：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，能够产生以下改变：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,假如迟缓冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。复苏过程应快融，目标是预防小冰晶形成大冰晶，即冰晶重结晶。,细胞培养基本技术,第95页,慢冻程序,4 10,分钟,20 30,分钟,80 16-18,小时,(,或隔夜,),液氮罐长久储存。,细胞培养基本技术,第96页,细胞复苏方法,（,1,）从液氮中取出冷冻管，快速投入,37,38,水浴中，使其融化（,1,分钟左右）；,（,2,）,5,分钟内用培养液稀释至原体积,10,倍以上；,（,3,）低速离心,10,分钟；,（,4,）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏细胞。,细胞培养基本技术,第97页,低温保护剂应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提升冻存效果。,惯用低温保护剂是,DMSO,，它是一个渗透性保护剂。,冻存液：,含,20%,血清培养基和,10%DMSO,（或,10,甘油）,DMSO,液用培养液配好，防止因暂时配制,产热,而伤害细,胞。,细胞培养基本技术,第98页,细胞欲冷冻保留时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目普通为,1x10,6,cells/ml,融合瘤细胞则以,5x10,6,cells/ml,为宜。,细胞培养基本技术,第99页,七、细胞培养污染和检测,细胞污染种类,细菌、真菌、酵母菌、霉菌和病毒,污染源,无菌操作技术不妥,操作室环境不佳,污染之血清,污染之细胞,细胞培养基本技术,第100页,细菌污染,细胞培养常见污染,最常见有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。,培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，,pH,改变。,污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最终变圆脱落死亡。,细胞培养基本技术,第101页,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最终因为营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,细胞培养基本技术,第102页,细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,支原体污染表现,荧光染料,Hoechst33258,染色法检测支原体,细胞培养基本技术,第103页,支原体污染电镜照片,煎蛋状和其它形状,细胞培养基本技术,第104页,白色念珠菌污染,细胞培养基本技术,第105页,Concentrating Cells,Protocol,To concentrate cells from a suspension culture(or resuspended cells from monolayer culture):,Transfer the cell suspension to a sterile centrifuge tube of appropriate size and centrifuge for,10 minutes at 800 g.,Note:,Certain cell lines are very sensitive to centrifugal force.,Carefully remove the supernatant without disturbing the cell pellet.,Add the desired volume of fresh medium gently to the side of the,tube and slowly pipette up and down 2 to 3 times to resuspend the,cell pellet.,Transfer the cells to the desired,sterile container.,细胞培养基本技术,第106页,Thank you!,细胞培养基本技术,第107页,