细胞培养基本技术-(2).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞是生命活动的基本单位,1665,年英国学者,Robert Hooke,，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文,Cella,（小室）词。,1838,年德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”的基本原则。,（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；,（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的“生命”。,（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。,进化论，遗传学和细胞学说定为现代生物学的三大基,石，而细胞学说又是后二者的,基石,。,细胞培养,从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。,细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。,细胞培养的基本概念,传代：,细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,原代培养,取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,有限细胞系，无限细胞系,细胞系,cell line,细胞株,cell strain,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式,贴附生长：,必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞,悬浮生长：,于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期,贴壁期,潜伏期,对数生长期,停止期（平台期）,游离期：,细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。,10,分钟一,4,小时,贴壁期：,细胞附着于,底物,上，游离期 结束。细胞株平均在,10,分钟一,4,小时贴壁。,底物,：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等,血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（,生长基质,），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。,进口塑料培养瓶涂有,生长基质,（化学合成的功能基团）,潜伏期,此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为,6,24,小时,。,对数生长期：,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）,：,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂,机制：接触抑制、密度依赖性,细胞生长状况的观察,细胞周期,G,2,M,G,0,G,1,s,0,DNA Analysis,Count,200,400,600,800,1000,G,0,G,1,s,G,2,M,DNA content,2N,4N,研究细胞动力学、细胞的,DNA,合成代谢和有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个周期来进行，包括：,有丝分裂期（,M,期）,分裂间期（生长期）：生长前期（,G1),、,DNA,合成期（,S,）、生长后期（,G2,）,细胞周期的检测方法,流式细胞仪测定法,培养细胞生长的条件,1,细胞的营养需要,2,细胞的生存环境,温度,:37,O,2,CO,2,:5%CO,2,+H,2,O H,2,CO,3,H,+,+HCO3,-,pH:7.2-7.4,渗透压,3,无污染,4,无毒,实验准备,实验用品：,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸,CO,2,培养箱,倒置显微镜,酶标仪、微孔板震荡器,液氮,罐,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：,湿热消毒，用途广,电热干燥箱：,干热消毒（,160 ,，,2,小时）。主要用干玻璃,器皿消毒,滤器：,过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、,酶液等均采用滤过法除菌,超净工作台：,为细胞操作提供无菌环境,紫外灯：,紫外线消毒。主要用于培养室,空气、操作台、塑料,培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐,徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,高压灭菌锅,不同压力蒸汽所达温度,压力（磅）,温度（度）,5,108.4,10,115.2,15,121.0,20,126.0,25,130.4,30,134.5,CO2,培养箱,CO2,培养箱设定的条件为,37,，,5,CO,2,。,使用,CO2,培养箱培养细胞时应注意的问题：,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。,保持培养箱内空气干净。定期消毒,箱内留蒸馏水,3000,毫升于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,常用消毒方法及选择,消毒物品,压力蒸汽,干热,过滤,紫外线,化学气体,化学消毒剂,电力辐射,抗生素,培养室,/,工作台,玻璃制品 ,金属器械 ,塑料制品 ,橡胶制品 ,培养用液 ,棉布类 ,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养瓶,常用玻璃器皿清洗,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（,24,小时）、,流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、,50,烘干,清洁液的配制,2,细胞培养用液的配制,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水,平衡盐溶液：无,Ca,2+,、,Mg,2+,的缓冲液,PBS,：,NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na,2,HPO,4,.H,2,O 1.56 g,KH,2,PO,4,0.20,加水至,1000 ml,消化液：,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。,胰蛋白酶液浓度,越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。,胰蛋白酶是一种黄白色,粉末，用无,Ca2+,、,Mg2+,的,PBS,缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是,0.25,。用滤器过滤除菌。,胰蛋白酶液消化时间：,2-10,分钟。,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。,天然培养基：,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,优点：营养成分丰富，培养效果好,缺点：来源受限。,成分复杂，,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析,。,易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如,TC199,、,MEM,、,RPMI-1640,、,DMEM,等。,合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。,优点：标准化生产，组分和含量相对固定。,成本低,缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有：,多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）,多种金属离子；,激素；,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。,各种生长因子,转移蛋白,不明成分,一般说来含,5,小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加,10,血清,对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚,血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如,激素、生长因子,、,结合蛋白,、,贴壁和扩展因子,等。,无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。,1975,年，,Sato,首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近,20,多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。,无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使,同源组织的不同细胞株，所需,补加物,也不同。,无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。,目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。,常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。,优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,血清的灭活（消除补体活性）：,56,，,30,分钟,血清的消毒：过滤除菌,抗菌素的使用：,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。,通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升,100,单位。,庆大霉素：每毫升,100,单位,方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础培养基,80,一,95,血清,5,一,20,碳酸氢钠,2.0 g/L,青、链霉素 各,100,单位毫升,培养基的配制,RPMI-1640,培养粉,1,袋,碳酸氢钠,2.0 g,青、链霉素 各,100,单位毫升,加三蒸水 至,1000ml,过滤除菌。,调节,pH,值至,7.2,加血清（终浓度,10,）,无菌技术概念,【,操作野消毒,】,无菌培养室每天都要用,0.2%,的新洁尔灭拖洗地面,次,(,拖布要专用,),，紫外线照射消毒,30-50min,，超净工作台台面每次实验前要用,75,酒精擦洗。然后紫外线消毒,30min,。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。,些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用,75%,酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【,洗手和着装,】,原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射,30min,的清洁工作服。在利用超净台工 作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始 操作前要用,75,酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗 手还要戴口罩、着消毒衣帽。,【,火焰消毒,】,在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶 口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,体外培养细胞的常见问题,体外培养细胞的分型,（一）贴附型：,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下 四型：,成纤维细胞型：,胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细 胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可 称之为成纤维细胞。,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的,来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：,真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，,血管内皮,形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则,三角形，胞质向外伸出,2,3,个长短不等的突起，,中有卵圆形核,生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，,细胞,细胞接触易断开而单独行动，游离的单独,的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,2,、上皮型细胞：,细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘 的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚 层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同,来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：,皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点：易相连成片，相靠,紧密相连,成薄层,铺石状,生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,3,、游走细胞型：,呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以 和其他细胞相区别。,小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞,4,、多型细胞型,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,（二）悬浮型,见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长,来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿瘤细胞,特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团,优点：生存空间大，提供数量大，传代方便,(,不需消化,),，易于收获，可获得稳定状态,缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长,(,尤以正常细胞,),细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有,3,种。,1.,悬浮生长细胞传代,离心法传代：离心（,1000,转,/,分,）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。,直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除,l,2,一,2,3,，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,2.,半悬浮生长细胞传代,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹,打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,3.,贴壁生长细胞传代,采用酶消化法传代。常用的消化液有,0.25,的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法：,1,、吸光培养瓶中的培养液,2,、加入,1-2 ml 0.25,的胰蛋白酶液,(,以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置,2-10 min,（显微镜下动态监测）。,3,、吸去胰蛋白酶液，加入培养液。,4,、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。,5,、吸取,1/101/40,细胞悬液，接种于新的培养瓶内。,6,、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。,7,、将后者放入培养箱中培养。,细胞传代培养,消化法,培养细胞的取材,取材的基本要求：,尽快培养,严格无菌操作,减少对细胞的机械损伤,去除坏死组织，避免组织块干燥,培养液营养丰富,易培养的组织成功率高,详细记录,原代细胞的培养,取材的基本器材和用品,眼科组织弯剪、弯镊、手术刀,小瓶装无血清培养基、,Hanks,液,小烧杯,培养皿,各部位组织的取材,皮肤和黏膜,内脏和实体瘤,血细胞,骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞,鼠胚组织,鸡胚组织,组织材料的分离,细胞悬液的分离方法：,血液、羊水、胸水、腹水等细胞悬液,离心分离，,5001000r/min,，,510min,组织块的分离方法,机械分散法,剪切分离法,消化分离法,机械分散法,纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。,方法：,1.,剪刀剪切，吸管反复吹打分散组织细胞。,2.,组织放在注射器内通过针头压出。,3.,注射器针芯挤压通过不锈钢筛网（,50,目、,200,目、,400,目）,剪切分离法,组织块移植培养时，将组织剪成或切成小块（,1cm,3,）用眼科剪反复剪切组织至糊状，吸取培养液反复吹打，低速离心去上清，再分离培养。,消化分离法,胰蛋白酶消化法,用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等，同时也用于培养的细胞。,pH,、温度、浓度、组织块大小和硬度。,0.10.5%,，常用,0.25%,pH=8,5mm,3,胚胎类软组织，,0.25%,胰蛋白酶，,37,，,20-30min,即可。,钙、镁离子及血清对胰蛋白酶有抑制作用。,分次消化,EDTA,较胰蛋白酶缓和，从组织环境中吸取钙、镁离子，破坏组织的完整性。,0.02%,，用不含钙、镁离子的,BSS,配置。,不能被血清中和，用洗涤、离心方法去除。,胰蛋白酶与,EDTA,联合使用提高效果，,1:1,或,1:2,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞,Coulter,计数仪：人工计数,细胞计数：,1,、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。,2,、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计 数板之间。,3,、静置,3,分钟。,4,、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和 上方的。,然后按下式计算：细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/410000,注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计 算，,若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。,1,细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖,6,代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。,克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力,克隆形成率比,克隆形成,数接种细胞数,缺点：操作繁琐,优点：精确、可靠,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占,细胞中的百分比表示细胞活力。,四唑盐（,MTT,）比色法,四唑盐,（,MTT,）,商品名为噻唑蓝,四,唑,盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四,唑,盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（,formazan),，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（,DMSO,）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的,formazan,量成正比。再用酶标仪测定,OD,值,MTT,法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试,验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤,（,1,）单细胞悬液接种于,96,孔培养板；,10,3,-10,4,细胞,/,孔，每孔培养基总量,200,微升（,96,孔培养板每孔容积,370,微升），,37,、,5,CO,2,培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）,（,2,）加入,2,毫克毫升的,MTT,液（,50,微升孔）；继续培养,3,小时。,（,3,）吸出孔内培养液后，加入,DMSO,液（,150,微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡,10,分钟，使结晶物溶解。,（,4,）酶标仪检测各孔,OD,值（检测波长为,570 nm,）。记录结果，绘制细胞生长曲线,其他染色方法,未固定凋亡细胞染色：,AO/EB,双染色法：,致密浓染黄绿色：早期凋亡细胞，,致密浓染鲜红色：晚期凋亡细胞，,鲜红色膨大状：坏死细胞,凋亡细胞固定后染色观察：,MGG,染色法：玻片晾干后用,MGG,染液染色,20 min,，光镜观察,Hoechst3325,染色法,HE,染色法,其他,：,Annexin V/PI,双染法：,正常活细胞,Annexin V,、,PI,均低染；,凋亡细胞,Annexin V,高染、,PI,低染；,坏死细胞,Annexin V/PI,均高染,TUNEL,染色：检测细胞凋亡,CFSE,染色：检测细胞增殖,AO/EB,双染色,原理：,AO,能够透过细胞膜，把细胞核内的,DNA,染成绿色，细胞浆内的,RNA,呈桔红色。早期凋亡细胞的细胞膜尚完整，细胞浆发生固缩，细胞核固缩或碎裂，因此呈致密浓染的黄绿色，有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的细胞膜通透 性增加，,EB,能够通过，使其呈鲜红色固缩体或碎块。坏死细胞不仅细胞膜不完 整，而且线粒体肿胀，为鲜红色的膨大细胞。,方法：,25 Ld,离壁漂浮的细胞悬液与,2 l AO,染液,(100 g/ml),和,2 l EB,染液,(100 g/ml),混合后滴片，立即用荧光显微镜观察。,结果：大部分细胞主要呈致密浓染的黄绿色染色或黄绿色碎片,(,早期凋亡细胞,),；部分细胞呈致密浓染的鲜红色染色或鲜红色碎片,(,晚期凋亡细胞,),；少部分为鲜红色的膨大细胞。而在正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染，细胞浆桔黄或桔红色。坏死对照大部分为鲜红色的膨大细胞。,MGG,染色,MGG,由,May-Grunwald,染料和,Giemsa,染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝,，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此,MGG,染色，可兼两者的优 点，常用于细胞涂片染色。,正常细胞呈细胞浆淡蓝色，细胞核粉红色着色。实验组的大部分细胞固缩变圆，整个细胞呈深蓝色。坏死对照为外形不规则的淡蓝色膨大细胞。,TUNEL,技术,TUNEL,是末端脱氧核苷酸转移酶（,terminal deoxynucleotidyl transferase,，,TdT,）介导的,dUTP,原位切口末端标记（,terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling TUNEL,）技术，是原位检测细胞凋亡情况的一种基本方法。细胞发生凋亡时，染色体,DNA,会发生断裂，,DNA,双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列,DNA,的,3-OH,末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（,TdT,）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和 荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到,DNA,的,3-,末 端，从而可进行凋亡细胞的检测。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序：,当温度在,-25,以上时，,1,2/min,当温度达,-25,以下时，,5,10/min,当温度达,-100,时，可迅速放入液氮中,细胞冻存器,简易程序：,将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以,线绳，通过线绳将,纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降,1,2,的速度，在,40,分钟内降至液氮表面，停,30,分钟后，直接投人液氮中。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。,常用的低温保护剂是,DMSO,，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1.,预先配制冻存液：含,20%,血清培养基,10%DMSO,2.,取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（,110,6,5 10,6,细胞,/ml),3.,加入,1ml,细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名,称和冷冻日期。,4,年后，存洁率可达,80,以上。,DMSO,液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,慢冻程序,一般程序：,1.,先将冻存管放入,4,冰箱，约,40min,。,2.,接着置于,-20,冰箱，约,30,60min,。,3.,置于,-80,超低温冰箱中放置过夜。,4.,置于液氮罐中长期保存。,细胞复苏方法,（,l,）从液氮中取出冷冻管，迅速投入,37,38,水浴中，使其融化（,1,分钟左右）。,（,2,）,5,分钟内用培养液稀释至原体积的,10,倍以上。,（,3,）低速离心,10,分钟。,（,4,）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,培养细胞的运输,冷冻储存运输：干冰,/,液氮,充液法,选择生长良好的细胞，弃去旧培养基，补充新培养液至培养瓶颈部，保留微量空气，瓶口用封口膜封口，运输。,若运输时间较短（数小时），可将细胞附着面朝上，或将培养液倒尽，贴身运输。,培养细胞的污染,不仅指微生物，而且包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物。,包括微生物、细胞和化学物质。,微生物污染的种类可分成细菌、真菌、病毒和支原体。,无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。,严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。,细菌和真菌的污染和检测,肉眼直接观察法,培养检查法,显微镜观察法,真菌污染,培养液中形成白色或浅黄色漂浮物,肉眼可见，短期内培养液不混浊,镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中，也可通过染色加以判断,。,细胞被白色念球菌污染,细胞被霉菌污染,细胞被真菌污染,细菌污染,多为大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等污染,污染后，培养基颜色短期变黄，出现浑浊,镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物，细胞生长停止并有中毒表现,可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定,多发生在接种的,48h,以内,小鼠胃癌细胞的球菌感染图片,支原体的污染和检测,支原体高污染率的原因：,支原体最小直径,0.2,m,，无细胞壁，约有,1%,可透过滤菌器,(0.22-0.45,m),；,支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；,过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式，研究人员忽略污染问题,。,支原体的检测,相差显微镜观察法,荧光染色法,电镜检查,DNA,分子杂交检查或支原体培养,