布氏乳杆菌细菌素BSX01对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响.pdf

研究论文布氏乳杆菌细菌素BSX01对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响江宇航12，）周寰宇12，辛维岗1.2，行何秀1.2，张棋麟12，林连兵*1,2（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明6 50 50 0；2.云南省高校饲用抗生素替代技术工程研究中心，云南昆明6 50 50 0）摘要：为评估布氏乳杆菌所产细菌素在食品工业中的应用潜力，通过培养布氏乳杆菌获得具有抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性物质，经纯化后鉴定其相对分子质量大小与抑菌特性，并对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成进行探讨。结果发现，布氏乳杆菌在3 7 MRS培养基中培养至2 0 h后进入稳定期，在2 6 h时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达峰值，为（2 6.3 6 0.8 6）mm。通过AKTApure系统串联Superdex30Increase纯化后，鉴定得到抑菌活性物质（BSX01）的相对分子质量为7 7 3.56，对多种蛋白酶敏感，推测为I类细菌素。在pH10(2h)和12 1(3 0 min）处理后，BSX01仍具有较好的抑菌活性，最小抑菌质量浓度（MIC)仅为12.50 g/mL。此外，BSX01在1/2MIC时可有效降低金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，在2 MIC时能够完全抑制生物被膜的形成。基于上述结果，布氏乳杆菌产生的细菌素BSXO1是食品工业中的潜在生物防腐剂和抑制食源性致病菌生物被膜形成的有效候选品。关键词：布氏乳杆菌；细菌素；金黄色葡萄球菌；抑菌特性；生物被膜中图分类号：TS 201文章编号：16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)11-0 0 19-0 8 DOl:10.12441/spyswjs.20210419004徐美余1,2,Effect of Lactobacillus buchneri Bacteriocin BSXO1 on Staphylococcus aureusand Its Biofilm FormationJIA NG Yuhang.-,ZHOU Huanyul,XIN Weigang2,XU Meiyu-,HE Xiul-2,ZHANG Qilinl-2,LIN Lianbing*1.2(1.School of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Engineering Research Center of Alternative Feed Antibiotics Technology in Universities of Yunnan Province,Kunming 650500,China)Abstract:This study aimed to evaluate the potential application of bacteriocins produced byLactobacillus buchneri(L.buchneri)in the food industry.The substance with antibacterial activityagainst Staphylococcus aureus(S.aureus)was obtained through the cultivation of L.buchneri.Afterpurification,its molecular weight and antibacterial characteristics were identified,and the inhibition收稿日期：2 0 2 1-0 4-19基金项目：国家自然科学基金项目（3 17 6 0 0 42)。*通信作者：林连兵（19 6 9 一），男，硕士，教授，博士研究生导师，主要从事噬菌体与肠道微生物研究。E-修回日期：2 0 2 1-0 7-11食品5生物技术学报2 0 2 3 年第42 卷第11期19RESEARCHARTICLEJIANG Yuhang,et al:Effect of Lactobacillus buchneri Bacteriocin BSXO1on Staphylococcus aureus and Its Biofilm Formationof S.aureus biofilm formation was explored.The results showed that L.buchneri reached a stableperiod after cultivation in MRS medium at 37 C for 20 h,and the diameter of inhibition zone againstS.aureus reached the peak value of(26.360.86)mm at 26 h.After purification by AKTA puresystem in tandem with Superdex 30 Increase,the molecular weight of the antibacterial activesubstance(BSX01)was identified as 773.56,which was sensitive to a variety of proteases andpresumed to be a class I bacteriocin.BSX01 retained good inhibitory activity even after treatment atpH 10(2 h)and 121 C(30 min),with a minimum inhibitory concentration(MIC)of only 12.50 g/mL.In addition,BSX01 effectively reduced the formation of S.aureus biofilm at 1/2MIC,and completelyinhibited the formation of S.aureus biofilm at 2MIC.Based on these results,the bacteriocin BSX01produced by L.buchneri is demonstrated to be a potential bio-preservative and an effective candidatefor inhibiting the formation of biofilm by foodborne pathogenic bacteria in the food industry.Keywords:Lactobacillus buchneri,bacteriocin,Staphylococcus aureus,antibacterial characteristics,biofilm金黄色葡萄球菌（Staphylococc aureus）属于革兰氏阳性球菌,是葡萄球菌属中的典型食源性致病菌代表,约有2 0%3 0%的人群携带此种病原菌 1-2 1。金黄色葡萄球菌污染食物后可通过食物处理者或食物表面感染人体或动物进而传播到整个食物链中，诱发皮炎、肺炎、骨髓炎和败血症等疾病发生，严重者可导致肌肉痉挛甚至休克 2 。同时，金黄色葡萄球菌能够耐高温、耐高渗，对磺胺类药物具有很强的耐药性，这使得很难对金黄色葡萄球菌进行防控阝3-4。金黄色葡萄球菌产生的主要毒素为肠毒素，其对大多数处理方法例如高温和低pH等具有相对较高的耐受性,进一步增加了食物中毒风险,5。此外，据欧洲食品安全局（EFSA)统计，欧洲2 0 17 年由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病事件有2 7 起，造成了3 52 人患病。我国2 0 11一2 0 16 年食源性疾病监测数据分析表明，金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病暴发总次数为3 14次,疾病总数为519 6 例，占细菌性食物中毒事件的2 0%以上，仅次于副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和沙门氏菌(Salmonella)。因此,找到有效方法减缓金黄色葡萄球菌污染造成的食品安全问题是十分重要的。生物被膜是指细菌为了适应生存环境黏附于有生命或无生命戊糖的表面,产生多糖基质等胞外聚合物将其自身包围形成的大量细菌聚集膜样结构化群落,具有耐热和耐干燥等特性 7-8 。细菌生物被膜形成的高密度结构使其在酸性和抗生素作用条件下也能很好生存，这严重阻碍了抗菌剂对细菌20JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 11 2023的抑制和杀伤8-9。当食品微生物形成生物被膜时，由于难以清洗和彻底去除，会出现餐厨设备表面破坏、传热效率低、能耗高等问题，这造成了极大的浪费 9-10 。因此，如何有效清除生物被膜是食品工业面临的严峻考验!。目前解决食源性致病菌形成生物被膜的相关研究主要集中在其形成能力和对环境耐受抗性等方面，关于借助微生物代谢产物抑制金黄色葡萄球菌等食源性致病菌形成的生物被膜研究较少。布氏乳杆菌（Lactobacillusbuchneri）是乳酸菌属中的一种，在食品发酵时具有增加有氧稳定性、提升发酵香味及抑制其他病原菌生长的效果 12-13 。同时，乳酸菌属的部分细菌在生长过程中能够代谢生成抑菌活性物质，可有效抑制或杀灭多种致病性细菌，具有高效、无耐药性、无毒、无残留等优点4。目前对乳酸杆菌细菌素作用于以金黄色葡萄球菌为代表的食源性致病菌及其对生物被膜形成的影响研究较少，这严重限制了乳酸杆菌细菌素在食品领域的应用范围 14-15。因此，作者在观测布氏乳杆菌生长及其抑制金黄色葡萄球菌活性的基础上，利用AKTA纯化系统串联Superdex30Increase及MALDI-TOFMS,得到纯化后的布氏乳杆菌细菌素。进一步考察酶敏感性,对热、酸碱稳定性以及最小抑菌质量浓度等特性，并借助荧光倒置显微镜进一步评估了布氏乳杆菌细菌素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响，旨在为金黄色葡萄球菌及其生物被膜的清除提供一种高效的抑菌活性物。研究论文江宇航，等：布氏乳杆菌细菌素BSXO1对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响步纯化得到的具有抑菌活性的收集液混合后,通过材料与方法Superdex30 Increase进行二次纯化，检测其抑菌活1.1实验材料布氏乳杆菌分离自发酵豆粕，金黄色葡萄球菌分离自肉类加工制品，均由昆明理工大学生命科学与技术学院噬菌体与肠道微生物研究室保存。1.2主要试剂MRS培养基、LB培养基：北京陆桥技术有限责任公司；磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)：国药（上海）化学试剂有限公司；0.2 2 m滤膜：上海生工生物工程股份有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶：美国Sigma公司;BCA试剂盒、ABP试剂盒：上海贝博生物科技有限公司。1.3仪器与设备PowerWaveXS微孔板扫描分光光度计：美国BIO-TEK有限公司;UV-900AKTA蛋白质纯化系统：瑞典GE公司；CHA-S恒温振荡器：国华电器有限公司；CF16RXII低温离心机、ES-2030型冷冻干燥仪：日立（Hitachi)有限公司;PHSJ-3FpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；荧光倒置显微镜：上海万衡精密仪器有限公司。1.4布氏乳杆菌的生长与抑制金黄色葡萄球菌活性曲线将活化后的布氏乳杆菌以体积分数3%接种于500mL的MRS液体培养基中,3 7 恒温培养,每2h(036h)取发酵液5mL，以MRS培养基作空白对照,测定OD6oo和pH值。同时,取发酵液2 mL于8000r/min离心10 min，收集上清液，经0.2 2 m滤膜过滤去除菌体细胞 6 。最后,以金黄色葡萄球菌为指示菌（10 7 CFU/mL,采用牛津杯双层平板法检测不同时间点的布氏乳杆菌细菌素（以下简称BSXO1)抑菌活性，每组设3 个重复。1.5细菌素的提取与纯化将布氏乳杆菌以体积分数3%接种于50 0 mL的MRS液体培养基中,3 7 培养2 4h，于4、8000r/min离心10 min，收集上清液。用0.2 2 m滤膜过滤去除菌体，将具有活性的无细胞上清液通过 AKTA pure 纯化系统,使用 Superdex 30 Increase层析柱，平衡2 个柱体积,在pH6.2条件下洗脱,洗脱体积为1.5倍柱体积,2 8 0 nm处检测细菌素含量，流量为0.3 mL/min，每0.5mL为一管进行收集，通过牛津杯双层平板法测定其抑菌活性。将多次初性 6.16 。最后,将经过2 次纯化得到的具有抑菌活性的收集液进行冷冻干燥，于4冰箱中保存备用。BSXO1的相对分子质量大小及蛋白质质量浓度的测定分别采用MALDI-TOF MS和BCA蛋白质检测试剂盒进行。细菌素相对分子质量大小测定：方法及流程参照文献 16 ,具体交由北京百派克生物科技有限公司进行；蛋白质质量浓度的测定：称取1.0 mg干粉溶于1mLddH2O中，按照BCA蛋白质检测试剂盒 6,17 说明绘制标准溶液曲线（y=1.062X+0.0163,R2=0.9923），计算每毫升溶液中的蛋白质质量，每个试样设置3 组重复。1.6细菌素的酶敏感性将上述纯化样品pH调至7.0,加人过氧化氢酶和不同蛋白酶溶液(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K)使其终质量浓度为1.0 mg/mL,37水浴2 h，然后于8 0 水浴10 min使蛋白酶活性丧失 8 。以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用牛津杯双层平板法检测不同酶溶液处理后的细菌素抑菌活性变化，记录抑菌圈直径。以未加酶溶液处理的BSXO01作为对照，每个试样设置3 组重复。1.7细菌素的热及酸碱稳定性测定取上述纯化样品，分别按以下处理进行细菌的热及酸碱稳定性测定。3 7、6 0、8 0、10 0、12 1处理30min后，自然冷却至室温；以1mol/L的HCl或Na0H溶液调节pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0,分别置于3 7 保温2 h，调至pH6.58-19。采用牛津杯双层平板法检测经不同处理后的细菌素溶液对金黄色葡萄球菌的抑制能力,以未经处理的BSX01为对照，每个样品设置3 组重复。1.8MIC测定BSXO1对金黄色葡萄球菌的MIC值参照文献 6,2 0 的方法测定。将BSX01(1.0mg/mL)在无菌PBS（p H 7.2）中连续稀释,并将10 L稀释液与90L含金黄色葡萄球菌(10 7 CFU/mL)的LB培养基混合 2 1。3 7 孵育2 4h,在6 0 0 nm处测定吸光度，每组重复3 次。MIC定义为：BSX01在3 7 培养2 4h后未观察到指示菌菌株生长的最低质量浓度 2 。每个样品设置3 组重复。1.9丝细菌素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响为观察细菌素对金黄色葡萄球菌生物被膜形食品5生物技术学报2 0 2 3 年第42 卷第11期21RESEARCHARTICLEJIANG Yuhang,et al:Effect of Lactobacillus buchneri Bacteriocin BSX01on Staphylococcus aureus and Its Biofilm Formation成的影响，首先用终质量浓度分别为0、1/2 MIC、1MIC、2 MI C 的BSX01与10 0 L金黄色葡萄球菌(107CFU/mL)添加到2 4孔微量滴定板中，在3 7 下恒温孵育3 0 h后形成生物被膜。弃上清液以去除未附着的金黄色葡萄球菌,用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤微量滴定板上的多余残留，得到金黄色葡萄球菌生物被膜。将金黄色葡萄球菌生物膜按照ABP试剂盒荧光成像检测的操作说明进行,加入1.0 L的NucViewGreen染料后在室温下对生物被膜染色15min,弃染色液,用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤2 次以上，去除游离的染色液，置于荧光显微镜下观察金黄色葡萄球菌生物被膜形成情况 7,2 。最后,加人100LPBS缓冲液(pH7.4)与各处理的金黄色葡萄球菌生物被膜混合后，测OD595，每个样品设置3组重复。1.10数据分析所有测得的数据均包含3 次生物学重复，以平均值标准差（SD）表示。利用MicrosoftExcel 2010和IBMSPSS22.0统计软件分别对数据进行整理分析。数据对间显著性检验利用t检验（StudentstTest)进行；采用One-WayANOVA进行单因素方差分析和最小显著差异法（Least-SignificantDifference,LSD)测验差异显著性 9,显著性水平阈值P0.05），初步说明过氧化氢不是主要的抑菌活性物质。利用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶分别对BSX01进行处理，结果发现BSX01经蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后,抑菌圈直径与对照相比发生了显著下降(P0.05),尤其是经蛋白酶K处理后，抑菌圈直径下降最为明显，仅为（9.8 3 0.3 2）mm，见图3。结果说明布氏乳杆菌产生的BSX01对蛋白酶敏感,存在着类蛋白质性质 18,2 5,17.06.56.05.55.04.514.033.5282412822JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSUe 11 2023研究论文江宇航，等：布氏乳杆菌细菌素BSXO1对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响B2B110080F510体积/mL(a)第一次纯化图A4A3A5A2A510(b)第二次纯化图Fig.2Purification and mass spectrum of BSX01进一步证实了布氏乳杆菌细菌素BSXO1为I类细菌素。3020100对照组胰蛋白酶蛋白酶K胃蛋白酶过氧化氢酶*代表P0.05,NS代表无显著差异。图3 BSX01的酶敏感性Fig.3Enzyme sensitivity of BSX012.4BBSX01的热及酸碱稳定性细菌素抑菌活性的高低仅代表该细菌素有较好的抑菌效果，然而实际应用中细菌素的稳定性也是影响工业化生产的重要因素。对BSXO1进行酸碱耐受与热稳定性测试,结果发现在过酸(pH2.0)和过碱(pH10.0)处理后,BSX01仍保持一定的抑菌活性。随着pH值的上升,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性逐渐下降，在pH10.0时抑菌圈直径最低，为（19.0 7 0.6 4）m m。但在pH10时,BSX01仍保持77.5%的抑菌活性，较同类研究 16,18 中经过相同处理后的抑菌活性更高,这说明BSX01在耐碱方面具有良好的耐受能力。同时,BSX01在3 7 12 1处理30min后，随着温度的升高抑菌圈活性逐渐下降，773.561520A6.A7人15.20体积/mLNS*252530图2 BSX01的纯化与质谱图且在高温区段(8 0、10 0、12 1)中抑菌活性损失较大,在8 0 时仅保留7 6.0%的抑菌活性。但12 1加热3 0 min后，抑菌活性也仅损失了不到40%，说明虽然BSXO1在高温处理后抑菌活性会有所损失，但仍然能够保留较高的抑菌活性，显示出较宽的温度应用范围 19 ,见图4。2.5BSX01的MIC及对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用最小抑菌浓度对于细菌素实际应用具有重要的意义。通过将不同质量浓度纯化后的BSXO1作用于金黄色葡萄球菌，确定得到最小抑菌质量浓度仅为12.50 g/mL，这与目前部分研究中抑制金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度一致 6.2 1。分别用0、1/2MIC、1MI C、2 MI C 的BSX01处理金黄色葡萄球菌，在3 7 培养3 0 h后通过荧光倒置显微镜进行观察,发现随着细菌素质量浓度的增加，生物被膜形成的密度逐渐下降,在1/2 MIC的BSX01处理后，其生物被膜形成的密度较对照发生了较大幅度下降；当以IMIC的布氏乳杆菌细菌素处理后，生物被膜形成的密度较对照相比仅有稀疏的金黄色葡萄球菌菌体出现；以2 MIC的BSXO1处理后，几乎无肉眼可见的生物被膜形成，这说明BSX01质量浓度的提高能够有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,且仅需要较低质量浓度的BSX01。此外,6 0 0 nm下的吸光度分别为1.2 3 0.14、0.6 6 0.18、0.3 8 0.2 9和0.2 3 0.0 6，进一步证明了获得的BSX01以低浓度就能够有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成 食品5生物技术学报2 0 2 3 年第42 卷第11期306040200625.79613.686874151,927.97427/63.46.0689500971.371000ml/z(c）质谱图1265.521509.0615002.00023RESEARCHARTICLEJIANGYuhang,et al:Effect of Lactobacillus buchneri Bacteriocin BSXo1on Staphylococcus aureus and Its Biofilm Formation*30*NS*NS30NSNS2020101037*代表P0.05,NS代表无显著差异。60温度/(a）热稳定性图4BSX01的热稳定性与酸碱耐受性Fig.4Thermal stability and acid-base tolerance of BSX0180100121对照2(b)酸碱耐受性4pH6810(a)0(b)1/2 MIC(c)1MIC图5不同MIC的BSX01抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成Fig.5 Inhibition effect of BSX01 with different MIC on the formation of Staphylococcus aureus biofilm3结语本研究证实了前期筛选得到的布氏乳杆菌在生长过程中产生了一种细菌素类代谢产物，其能够对金黄色葡萄球菌起到明显抑制作用。该细菌素(BSX01)的相对分子质量为7 7 3.56,对蛋白酶敏感，具有类蛋白质性质,推测为I类细菌素,并对温度和pH表现出较高的耐受性，最低抑菌质量浓度仅为12.50g/mL。同时,该细菌素在不同MIC的抑菌质参考文献：1 J GARCIA A,MARTINEZ C,JUAREZ R I,et al.Methicillin resistance and biofilm production in clinical isolates of Staphylococcusaureus and coagulase-negative Staphylococcus in MexicoJ.Biomedica:Revista Del Instituto Nacional De Salud,2019,3924JOURNALOFFOOD.SCIENCEAND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue112023(d)2MIC量浓度下均能明显抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，在减缓金黄色葡萄球菌生物被膜形成方面效果显著。研究结果证实，布氏乳杆菌产生的细菌素类抑菌物质具有良好抑菌特性，具有高效的抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力,为将该细菌素应用于食品工业中防治以金黄色葡萄球菌为代表的食源性致病菌及其生物被膜引发的相关问题提供理论基础。研究论文江宇航，等：布氏乳杆菌细菌素BSXO1对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成的影响(3):513-523.【2 黄欣悦，陈娟，马欣玥.食品中金黄色葡萄球菌定量风险评估的研究进展 .食品工业科技，2 0 2 1,42(2 2)：3 9 0-3 9 7.HUANG X Y,CHEN J,MA X Y.Research progress of quantitative risk assessment of Staphylococcus aureus in foodJJ.Scienceand Technology of Food Industry,2021,42(22):390-397.(in Chinese)3 J YU H,LIU M,LIU Y,et al.Antimicrobial activity and mechanism of action of Dracocephalum moldawica 1.extracts againstclinical isolates of Staphylococcus aureusJj.Frontiers in Microbiology,2019,10:1249.4 J ROBERTS S,GRAE N,MUTTAIYAH S,et al.Healthcare-associated Staphylococcus aureus bacteraemia:time to reduce theharm caused by a largely preventable eventJ.The New Zealand Medical Journal,2020,133(1509):58-64.【5 李雅倩，胡同平.金黄色葡萄球菌毒力因子的研究进展 .中华医院感染学杂志,2 0 2 0,3 0(17)：2 7 12-2 7 16.LIY Q,HUTONG P.Advance in study of 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