pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响.pdf

第36卷第3期2023年9月Vol.36 No.3Sep.2023闽南师范大学学报（自然科学版）Journal of Minnan Normal University（Natural Science）pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响李云冰1,吴启赐1,2*,方月红1,周娱希1,林志超1,2（1.闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建 漳州 36300；2.福建省菌类活性物质工程技术研究中心,福建 漳州 36300）摘要：探讨不同pH值和盐条件下混合模式层析介质（MMA Focurose 6FF）与离子交换层析介质（DEAE Focurose 6FF）的牛血清白蛋白（BSA）吸附性能.结果显示：1）未加盐时，两种介质均在BSA等电点附近有最大饱和吸附容量Qm，当pH值偏离等电点，Qm下降，表观解离常数Kd升高；2）添加NaCl后，MMA介质的BSA吸附受盐浓度影响较小，中低盐条件下有较高Qm，DEAE介质在低盐时可吸附BSA，但随NaCl浓度升高，Qm急剧下降，高盐下几乎不吸附；3）添加(NH4)2SO4后，MMA介质出现“U”型吸附规律，0.500.75 mol/L时Qm最低，高盐时Qm可恢复60%以上，且pH值越高，恢复比例越大，DEAE介质基本不吸附BSA.结果表明，混合模式介质具更佳的耐盐吸附性能，本结果可为蛋白分离设计提供参考.关键词：混合模式层析；离子交换层析；吸附性能中图分类号：TQ028 文献标志码：A 文章编号：2095-7122（2023）03-0098-09Influence of pH value and salt on protein adsorption performances with different chromatography resinsLI Yubing1,WU Qici1,2*,FANG Yuehong1,ZHOU Yuxi1,LIN Zhichao1,2(1.Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University,Zhangzhou,Fujian 363000,China;2.Fujian Engineering Technology Research Center of;Fungal Active Substances,Zhangzhou,Fujian 363000,China.)Abstract:This paper discusses the adsorption performances of bovine serum albumin(BSA)on mixed-mode chromatography resin(MMA Focurose 6FF)and ion exchange chromatography resin(DEAE Focurose 6FF)under different pH value and salt conditions.The results show that:1)When no salt is added,the maximum saturated adsorption capacities(Qm)are found near the isoelectric point of BSA for the two resins.When the pH value deviates from the isoelectric point,Qm decreases and the apparent dissociation constant(Kd)increases.2)When NaCl is added,the BSA adsorption on MMA resin is less affected by the salt addition.Moreover,higher Qm values are found under the medium and low salt concentrations.DEAE resin can adsorb BSA at low salt concentration,but Qm decreases sharply with the increase of NaCl concentration.In addition,it can hardly adsorb BSA at high salt concentration.3)When(NH4)2SO4 is added,MMA resin shows a U type adsorption trend.The lowest level of Qm appears in the range of 0.500.75 mol/L(NH4)2SO4.Besides,Qm recovers more than 60%at high salt condition.The higher the pH is,the greater the recovery ratio is.Interestingly,DEAE resin can hardly adsorb BSA at the same conditions.The results indicate that mixed-mode resin have higher salt tolerance,which is expected to provide reference for the design of protein separation.Key words:mixed-mode chromatography;ion exchange chromatography;adsorption performance收稿日期：2022-10-20基金项目：福建省中青年教师教育科研项目(JAT180306)；福建省自然科学基金面上项目(2020J01822)；国家科技项目备案(2021L3027)作者简介：李云冰(1998)，女，福建惠安人，硕士生.*通信作者.E-mail:李云冰，等：pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响第3期蛋白质是机体的重要组成部分，与生命活动紧密联系在一起.人体经常因为缺乏某种蛋白而患上疾病，因而相应功能蛋白的补充显得尤为重要，所以功能蛋白的高效制备和生产研究具有重大意义.层析是生物大分子分离纯化的重要技术手段，而通常情况下，为获得高纯度蛋白，需组合多种层析分离方法1.离子交换层析利用蛋白质的表面电荷与带电配基之间的静电作用差异实现分离，是蛋白分离的最常规方法2.然而当料液比较复杂、离子浓度较高（电导率达到1530 mS/cm）时，层析介质的蛋白吸附容量急剧下降.虽可通过稀释预处理来提高吸附容量，但同时也增加了操作成本，整体效率不高.疏水层析必须在高盐下才能实现有效吸附，容易增加能耗，不利于规模化生产.亲和层析特异性强，但适用范围小，介质价格昂贵，性价比很低.体积排阻层析通常用于小批量样品，效率较低.因此，加强过程集成，研发高效简便的分离新方法，对蛋白制备具有重要意义.混合模式层析（mixed-mode chromatography，MMC）是一种生物分离新方法，配基兼有疏水、离子化基团和氢键等，适当条件下，疏水、离子化基团和氢键可协同作用促进蛋白结合；改变溶液pH值，离子化基团与蛋白带有相同电性，从而产生静电排斥作用，协助蛋白解吸；或改变溶液离子浓度，增强静电屏蔽作用，进而降低配基与蛋白相互作用，实现蛋白分离.Schwartz等3采用混合模式介质MEP HyperCel从山羊奶中分离单克隆抗体，纯度达到了Protein A亲和层析的水平，而且洗脱条件更温和.Johansson等4研究发现，在离子化基团的基础上构建氢键，可增加配基的耐盐特性.罗颖娣等5通过pH值和盐浓度优化实现多种抗体的选择性分离.因此，在多模式的协同作用下，混合模式层析具有吸附容量高、洗脱条件温和、耐盐性好、选择性高等特点，可用于高盐原料液的蛋白初分离.为构建高效的蛋白吸附分离工艺，本文以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为模型蛋白，系统考察了不同pH值和盐溶液对混合模式层析介质（MMA Focurose 6FF）与离子交换层析介质（DEAE Focurose 6FF）的蛋白吸附特性，旨在为蛋白分离过程优化设计提供指导.1 材料与方法1.1 材料与试剂MMA Focurose 6HF（MMA介质，离子载量90120 Cl mol/mL，粒径45165 m）、DEAE Focurose 6FF（DEAE介质，离子载量110160 Cl mol/mL，粒径45165 m），武汉汇研生物科技股份有限公司；BSA，国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为市售分析纯，现配现用.1.2 仪器设备恒温混匀仪（HX-20T），上海沪析实业有限公司；超微量分光光度计（MA 150），德国赛多利斯集团；电子天平（TX323L），梅特勒-托利多仪器有限公司；pH计（EL20），梅特勒-托利多仪器有限公司.1.3 实验方法1.3.1 缓冲溶液选择0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液和磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠缓冲液作为母液，分别配制不同pH值的20 mmol/L缓冲液，并在此基础上，加入NaCl和(NH4)2SO4，配制不同盐浓度的工作液.1.3.2 蛋白静态吸附蛋白的静态吸附平衡实验参照文献6-7进行.1）考察pH值、盐种类和盐浓度对蛋白静态吸附的影响不同pH值缓冲液分别为乙酸-乙酸钠缓冲液（20 mmol/L，pH值范围为4.05.0）和磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠缓冲液（20 mmol/L，pH值范围为6.08.0）.盐种类包括NaCl和(NH4)2SO4，盐浓度添加量设置为992023年闽南师范大学学报（自然科学版）01.0 mol/L.2）蛋白静态吸附8分别将0.04 g抽干介质与1 mL不同浓度的BSA溶液（pH值范围为4.08.0，盐浓度范围为01.0 mol/L）混合，置恒温混匀仪中震荡6 h（1 500 r/min、25），待吸附达到平衡后离心（3 000 r/min，2 min），在280 nm处测定上清液BSA浓度.3）吸附等温线根据物料平衡计算介质的BSA吸附容量，绘制BSA吸附等温线.即Q*=(C0-C*)Vem.（1）其中：Q*为平衡时BSA吸附容量(mg/g resin)；C0为初始BSA浓度(mg/mL)；C*为平衡时上清液BSA浓度(mg/mL)；Ve为BSA溶液体积(mL)；m为称取的介质质量(g).4）Langmuir吸附平衡方程拟合采用Langmuir 吸附平衡方程对吸附等温线进行拟合.即Q*=QmC*C*+Kd.（2）其中：Qm饱和吸附容量(mg/g resin)；Kd为表观解离常数(mg/mL)；C*为吸附平衡时上清液中蛋白浓度(mg/mL).1.3.3 蛋白与配基的性质计算BSA分子结构（PDB ID：4F5S）由Protein Data Bank数据库获得，MMA和DEAE配基分子结构由Molecular Operating Environment（MOE，Montreal，Qubec，Canada）软件包直接构建，并参照文献方法进行处理8.采用MOE去除BSA结构中的水分子和共溶质，并设定不同pH值，在Amber99分子力场中完成Protonate 3D质子化和能量最小化.配基在Protonate 3D质子化（pH值范围为4.08.0）后，也需要完成能量优化（MMFF94x力场）.BSA和配基的表面结构和带电性质由MOE软件中的Descriptor模块完成计算.1.3.4 数据处理方法所有实验都做3次平行，图中用XSD表示.采用GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析，利用One-Way ANOVA对数据进行检验，显著性水平设为0.05.2 实验结果与分析2.1 介质配基和BSA相关参数分析MMA Focurose 6HF和DEAE Focurose 6FF介质配基结构如图1所示，MMA Focurose 6HF和DEAE Focurose 6FF的配基均含有季胺基，可提供阴离子交换作用，而MMA配基则拥有一个苯环和三个羟基，可分别为蛋白吸附提供疏水作用和氢键作用.图1 MMA Focurose 6HF和DEAE Focurose 6FF介质配基结构Fig.1 Ligand structures of MMA Focurose 6HF and DEAE Focurose 6FF resin100李云冰，等：pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响第3期表1 采用MOE计算配基和BSA的关键描述符Tab.1 The key descriptors of ligands and BSA calculated with MOE参数MMA Focurose 6HFDEAE Focurose 6FFBSApH值456784567845678形式电荷总数11111111116-1-5-11-16正电荷总数6.076.076.076.076.072.522.522.522.522.521 144.981 142.981 141.511 139.171 137.25负电荷总数-1 139.31-1 144.31-1 146.15-1 149.80-1 152.87范德华表面积395.36395.36395.36395.36395.36200.66200.66200.66200.66200.6666 818.1166 787.8866 774.1466 754.2566 739.20芳香原子数6666600000385385385385385氢键受体原子数5555511111718708711719727供体原子数3333300000692682685693701原子总数88888111111 4101 3901 3961 4121 428结果显示，MMA和DEAE拥有相同的形式电荷总数，但部分正电荷和负电荷总数有明显差别，因而在与蛋白的作用时可能呈现不同的作用规律.MMA的范德华表面积约为DEAE的2倍，而芳香原子数比例为6 0，说明MMA的疏水性强于DEAE.据文献报道，配基中芳香基团可在高盐情况下提供疏水作用，展现配基耐盐特性9.此外，二者的氢键受体和供体原子总数比为8 1，意味着MMA可形成更多的氢键，有利于蛋白的结合.BSA的形式电荷随pH值升高发生明显变化，从pH=4时的6个正电荷到pH=8时的16个负电荷，电荷数的变化对蛋白的吸附有直接的影响；范德华表面积随pH值升高而略微降低，但总体变化不大，因而BSA疏水性变化趋势不明显.pH=5时氢键受体和供体原子总数最低，说明该pH值下氢键影响比较小.2.2 pH值对BSA吸附性能的影响蛋白质是典型的两性解离物质，根据溶液环境的pH值和离子强度，其表面净电荷可发生变化.因此，通过改变溶液pH值和离子浓度可改变蛋白质与介质所带净电荷，从而影响两者间的静电作用，实现蛋白的吸附与解离.分别考察了未添加盐情况下pH值对MMA和DEAE介质的BSA吸附性能影响，结果如图2所示.图2(A)和图2(B)显示了MMA和DEAE介质的BSA吸附等温线，经Langmuir吸附平衡方程拟合，得到两种介质的饱和吸附容量（Qm）和表观解离常数（Kd），见图2(C)和图2(D).由图2（分别与pH=5.0的Qm或Kd比较：ns表示P0.05，为差异不具有统计学意义；a和b分别表示P0.001和P5时，采用MOE软件计算不同pH值下配基和BSA的系列参数，其中关键描述符列于表1，包括（FCharge）、部分正电荷和负电荷总数（Q_PC+和Q_PC-）、范德华表面积（vdw_area）、芳香原子数（a_aro）、氢键受体或供体原子数（a_acc/a_don）、氢键受体和供体原子总数（a_donacc）等.-5.07-5.07-5.07-5.07-5.07-1.52-1.52-1.52-1.52-1.521012023年闽南师范大学学报（自然科学版）对于表观解离常数Kd，MMA和DEAE两种介质均在pH=4.0达到了最高值（分别为4.92和4.93 mg/mL），说明低盐酸性条件有利于BSA的解吸.当pH=5.0时，Kd则急剧下降至0.067和0.13 mg/mL，分别下降了72.43和36.92倍，表明该pH值下BSA与MMA配基之间有更强的相互作用，较难解离.在pH值在6.08.0范围内，Kd相比于pH=5.0略有提升，MMA和DEAE介质的Kd分别为0.120.29 mg/mL和0.130.21 mg/mL，说明提高pH值削弱了BSA与配基的相互作用.两种介质的最大Qm均出现在BSA等电点附近，与文献10-13报道一致.BSA等电点为pH=4.914.并由表1可知，当pH值靠近等电点时，BSA表面净电荷为-1，但是蛋白表面正负电荷的不均匀分布却仍可提供静电吸引作用15.此时范德华表面积也比较大，蛋白疏水性较强，也有利于配基的疏水结合，所以在pH=5.0时出现最大Qm.虽然pH=4.0时，BSA拥有最大的范德华体积和氢键受体和供体总数，但此时BSA带正电，MMA和DEAE配基也带正电，因而蛋白与配基之间还存在静电排斥作用，所以Qm低于pH=5.0条件.此外，DEAE介质离子载量高于MMA，意味着可提供更多的蛋白结合位点，所以DEAE介质pH=4.0时的Qm高于MMA.pH值在6.08.0范围内，BSA总负电荷明显增多，意味着蛋白与配基之间将有更强的静电吸引作用，但Qm却缓慢下降，可能是由于BSA本身是疏水性很强的生物大分子，疏水性表面的变化所引起 (C)DEAE介质的BSA吸附等温线 (D)DEAE介质的Qm和Kd图2 不同pH值下MMA和DEAE介质对BSA的吸附性能Fig.2 BSA adsorption properties with MMA and DEAE resins at different pH value两种介质的吸附容量也呈现下降趋势，其中DEAE介质下降得更加明显，在pH=8.0时Qm下降了40.28%，明显高于MMA介质的30.00%.pH值 pH值Kd/(mg/g)Qm/(mg/g)C*/(mg/mL)Q*/(mg/g)Qm/(mg/g)C*/(mg/mL)(A)MMA介质的BSA吸附等温线 (B)MMA介质的饱和吸附容量Qm和表观解离常数KdQ*/(mg/g)102李云冰，等：pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响第3期对于MMA介质，添加NaCl后，BSA吸附量与DEAE介质相比下降趋势更平缓.pH5时，Qm呈阶梯式下降，0.125和0.25 mol/L NaCl条件下，Qm下降至45.01和36.35 mg/g，分别下降了41.21%和52.52%.随着NaCl浓度进一步提高，Qm持续下降.当NaCl浓度提高到1 mol/L时，Qm降低至4.82 mg/g.pH5.0时，低盐下（0.125 mol/L NaCl）Qm保持在68.3078.02 mg/g resin.pH=5.0时下降比例达25.70%.随着pH的增大，下降趋势逐渐减小.中等盐浓度下（0.25 mol/L NaCl），Qm进一步下降，pH=5.0 下降最明显，下降比例高达 58.08%，pH 值在 6.08.0 范围时，下降了 20.61%32.70%，此时 Qm为 58.3560.90 mg/g.而高盐下 (A)MMA介质 (B)DEAE介质图3 不同NaCl浓度条件下MMA和DEAE介质对BSA的饱和吸附容量QmFig.3 Qm of BSA with MMA and DEAE resins at different NaCl concentrations (A)MMA介质 (B)DEAE介质 图4 不同NaCl浓度条件下MMA和DEAE介质对BSA的表观解离常数KdFig.4 Kd of BSA with MMA and DEAE resins at different NaCl concentrations的削弱效应可能超过电荷变化带来的影响.2.3 NaCl的影响蛋白层析分离时需考虑到离子浓度对蛋白吸附和解离的影响.因此，比较了不同pH值和NaCl浓度下两种介质对BSA的吸附性能，结果见图3（分别与0 mol/L的Qm比较：ns表示P0.05，为差异不具有统计学意义；a表示P0.000 1，为差异极具有统计学意义）和图4（分别与0 mol/L的Kd比较：ns表示P0.05，为差异不具有统计学意义；a表示P0.05，为差异具有统计学意义；b、c和d分别表示P0.01、P0.001和P0.000 1，均为差异极具有统计学意义）.Kd/(mg/mL)pH值 pH值Kd/(mg/mL)pH值 pH值Qm/(mg/g)Qm/(mg/g)1032023年闽南师范大学学报（自然科学版）(A)MMA介质 (B)DEAE介质图5 不同(NH4)2SO4浓度条件下MMA和DEAE介质对BSA的饱和吸附容量QmFig.5 Qm of BSA with MMA and DEAE resins at different(NH4)2SO4 concentrations（1 mol/L NaCl）MMA介质可吸附少量BSA，Qm约为10 mg/g.对于DEAE介质，pH5时，添加NaCl后，BSA吸附容量急剧下降，在0.1251 mol/L范围内迅速降低至极低的水平（2.012.82 mg/g），可视为几乎不吸附，该条件有利于蛋白解吸.pH5时，低盐下（0.125 mol/L NaCl）该介质依然具有较高的吸附水平，Qm保持在63.0280.02 mg/g，pH=5.0时下降比例高达44.87%，其余pH值下降比例不足 20%.但是，随着 NaCl浓度的进一步提高到 0.25 mol/L 时，Qm迅速下降至较低水平，pH=5.0下降趋势最明显（下降了93.03%），pH值在6.08.0范围内下降了约80%，Qm为13.2519.85 mg/g.而高盐条件下（1 mol/L NaCl）DEAE介质几乎不吸附BSA.图4显示了不同盐浓度下两种介质的表观解离常数Kd.未添加NaCl时，在pH值在5.08.0范围内，两种介质Kd均小于1 mg/mL.说明该条件下BSA解离特性较差，配基与BSA间相互作用较强，有利于BSA吸附.添加0.125 mol/L NaCl后，MMA介质在pH值5.08.0范围内，Kd也保持了较低的水平（均小于1 mg/mL）.随着NaCl浓度的提高，Kd缓慢升高，高盐下（1 mol/L NaCl）Kd值为7.668.76 mg/mL.对于DEAE介质，加盐后Kd迅速提升，高盐情况下（1 mol/L NaCl）Kd可达8.669.66 mg/mL，显然高于同等条件下的DEAE介质，说明NaCl严重削弱了BSA与DEAE配基的静电相互作用，有利于BSA的解吸，从另一角度体现了MMA介质的优异耐盐吸附性能.NaCl是一种典型中性盐，能够在较少改变疏水作用前提下有效屏蔽静电作用16-18.添加NaCl可以破坏BSA和配基之间的静电作用，从而导致介质饱和吸附容量Qm下降和表观解离常数Kd升高.MMA配基不仅拥有强疏水性苯环，其氢键供体和受体总数也多于DEAE.因此，疏水作用和氢键双重作用下，Qm受盐浓度影响最小，最终表现为在中低盐下（0.1250.25 mol/L NaCl）也依然保持较高Qm，并且pH越高，Qm下降比例越小.对于DEAE，静电作用可能是介质吸附BSA的主要作用力.因此，在低盐时介质具有比较理想的Qm，但随NaCl浓度升高，静电作用被屏蔽，Qm下降明显，而高盐下几乎不吸附BSA.2.4(NH4)2SO4的影响进一步探究不同pH值和(NH4)2SO4浓度下两种介质的BSA饱和吸附容量及表观解离常数变化，结果如图 5（分别与 0 mol/L的 Qm比较：ns表示 P0.05，为差异不具有统计学意义；a和 b分别表示 P0.001和P0.000 1，均为差异极具有统计学意义）和图6（分别与0 mol/L的Kd比较：ns表示P0.05，为差异不具有统计学意义；a表示P0.05，为差异具有统计学意义；b、c和d分别表示P0.01、P0.001和P0.000 1，均为差异极具有统计学意义）所示.Qm/(mg/g)pH值 pH值Qm/(mg/g)104李云冰，等：pH值和盐对不同层析介质的蛋白吸附性能影响第3期与添加NaCl相比，MMA介质表现了不一样的BSA吸附现象.如图5A所示，随着(NH4)2SO4浓度的增加，Qm呈现先下降后上升的“U”型变化规律.pH5情况下，0.5 mol/L(NH4)2SO4时，Qm达到最低水平（6.98 mg/g），盐浓度进一步提高，吸附容量逐渐回升，Qm恢复至未加盐时的73.17%.pH5时，最低水平的Qm基本出现在0.50.75 mol/L内，1 mol/L时Qm可恢复至60.78%78.91%，并且pH值越高，恢复比例越大.对于DEAE介质，(NH4)2SO4对BSA吸附性能的影响比NaCl更加显著.pH5时，Qm变化规律与添加NaCl的趋势一致，Qm迅速降低至极低的水平.pH5时，在0.125 mol/L(NH4)2SO4的低盐情况下，Qm仅有8.3014.51 mg/g，下降了81%以上，pH=5.0时下降比例高达93.31%.随着(NH4)2SO4浓度的进一步提高，Qm迅速下降至更低水平，0.25 mol/L时各pH值条件下Qm下降比例均超过92%.而在1 mol/L(NH4)2SO4的高盐条件下，仅pH=5.0时能吸附少量BSA（Qm为8.09 mg/g）.两种介质的表观解离常数Kd变化趋势有所差别.MMA介质的Kd值随盐浓度的增加呈现先增大后减小的趋势，大部分pH值下盐浓度达到0.5 mol/L时，Kd均已达到最大值.而DEAE介质在添加0.125 mol/L(NH4)2SO4后，Kd值迅速增大，并且在(NH4)2SO4浓度升高后继续增大.(NH4)2SO4是一种典型的亲液盐19-20，能够帮助水分子维持其网络结构稳定性，并且在低盐浓度下可屏蔽部分静电作用，高盐浓度下促进疏水作用21.当离子浓度较低时，静电作用占主导，随离子浓度增大，静电作用减少，疏水作用占主导，硫酸铵可以促进疏水作用，从而增强吸附.因此，混合模式MMA介质的蛋白吸附会出现“U”型的吸附规律，而DEAE介质受电荷影响比较明显.上述结果表明，MMA介质拥有更加出色的耐盐吸附性能，可用于发酵液原料的蛋白吸附.3 结论以BSA为模型蛋白，MMA Focurose 6HF和DEAE Focurose 6FF为模型介质，系统考察了pH值、NaCl浓度和(NH4)2SO4浓度对蛋白吸附性能的影响，得到如下4点结论：1）未添加盐时，pH值影响非常显著，两种介质均在BSA等电点附近有最佳吸附，饱和吸附容量Qm分别为105.01和127.02 mg/g.当pH值偏离等电点，Qm下降，表观解离常数Kd升高.2）添加NaCl后，MMA介质主要通过疏水作用和氢键作用吸附BSA，因此Qm受盐浓度影响较小，在中低盐下（0.1250.25 mol/L NaCl）也依然保持较高的Qm，并且pH值越高，Qm下降比例越小.DEAE介质可能主要通过静电作用吸附BSA，在低盐时Qm比较理想，但随NaCl浓度升高，静电作用被屏蔽，Qm下降明显，而高盐下几乎不吸附BSA.3）添加(NH4)2SO4后，MMA介质出现“U”型吸附规律，最低水平的Qm基本出现在0.50.75 mol/L内，(A)MMA介质 (B)DEAE介质图6 不同(NH4)2SO4浓度条件下MMA和DEAE介质对BSA的表观解离常数KdFig.6 Kd of BSA with MMA and DEAE resins at different(NH4)2SO4 concentrationsKd/(mg/mL)pH值 pH值Kd/(mg/mL)1052023年闽南师范大学学报（自然科学版）1 mol/L时Qm可恢复至未加盐时Qm的60%以上，并且pH值越高，恢复比例越大.而DEAE介质受电荷影响比较明显，加盐后基本不吸附BSA.4）混合模式MMA介质拥有更加出色的耐盐吸附性能，因此可用于高离子浓度原料的蛋白吸附分离.参考文献：1 CHEN Z,HE Y,SHI B,et al.Human serum albumin from recombinant DNA technology:Challenges and strategiesJ.Biochim Biophys Acta,2013,1830(12):5515-5525.2 STABY A,JENSEN I H,MOLLERUP I.Comparison of chromatographic ion-exchange resins:I.Strong anion-exchange resinsJ.Journal of Chromatography A,2000,897(1-2):99-111.3 SCHWART W,JUDD D,WYSOCKI M,et al.Comparison of hydrophobic charge induction chromatography with affinity chromatography on protein A for harvest and purification of antibodiesJ.Journal of Chromatography A,2001,908(1-2):251-263.4 JOHANSSON B L,BELEW M,ERIKSSON S,et al.Preparation and characterization of prototypes for multi-modal separation media aimed for capture of negatively charged biomolecules at high salt conditionsJ.Journal of Chromatography A,2003,1016(1):21-33.5 罗颖娣.混合模式介质吸附抗体的选择性及分离应用研究D.杭州:浙江大学,2018.6 LU H L,LIN D Q,ZHU M M,et al.Effects of ligand density and pore size on the adsorption of bovine IgG with DEAE ion-exchange resinsJ.Journal of Separation Science,2012,35(16):2131-2137.7 LU H L,LIN D Q,ZHU M M,et al.Protein adsorption on DEAE ion-exchange resins with different ligand densities and pore sizesJ.Journal of Separation Science,2012,35(22):3084-3090.8 吴启赐.混合模式层析和扩张床吸附分离重组人血白蛋白研究D.杭州:浙江大学,2017.9 ZHAO G F,DONG X Y,SUN Y.Ligands for mixed-mode protein chromatography:Principles,characteristics and designJ.Journal of Biotechnology,2009,144(1):3-11.10 褚文宁,林东强,姚善泾.基于微孔过滤板的蛋白吸附高通量筛选方法J.化工学报,2017,68(6):2399-2406.11 XIA H F,LIN D Q,CHEN Z M,et al.Influences of ligand structure and pH on the adsorption with hydrophobic charge induction adsorbents:A case study of antibody IgYJ.Separation Science and Technology,2011,46(12):1957-1965.12 TONG H F,LIN D Q,YUAN X M,et al.Enhancing IgG purification from serum albumin containing feedstock with hydrophobic charge-induction chromatographyJ.Journal of Chromatography A,2012,1244:116-122.13 CHU W N,WU Q C,ZHANG Q L,et al.High-throughput process development for recombinant human serum albumin separation from pichia pastoris broth with mixed-mode chromatographyJ.Industrial and Engineering Chemistry Research,2019,58(8):3238-3248.14 GAO D,LIN D Q,YAO S J.Protein adsorption kinetics of mixed-mode adsorbent with benzylamine as functional ligandJ.Chemical Engineering Science,2006,61(22):7260-7268.15 GAO D,LIN D Q,YAO S J.Mechanistic analysis on the effects of salt concentration and pH on protein adsorption onto a mixed-mode adsorbent with cation ligandJ.Journal of Chromatography B,2007,859(1):16-23.16 ZHANG Q L,SCHIMPF F,LU H L,et al.Binary adsorption processes of albumin and immunoglobulin on hydrophobic charge-induction resinsJ.Journal of Chemical and Engineering Data,2016,61(3):1353-1360.17 WANG S H,LI X X,SUN Y.Poly(N,N-dimethylaminopropyl acrylamide)-grafted Sepharose FF:A new anion exchanger of very high capacity and uptake rate for protein chromatographyJ.Journal of Chromatography A,2019,1597:187-195.18 LI M T,LIN D Q,YAO S J,et al.Study on antibody adsorption and elution performance of carboxyl and hydrophobic groups on mixed-mode ligandsJ.Journal of Separation Science,2022,45(15):2946-2955.19 LIENQUEO M E,MAHN A,SALGADO J C,et al.Current insights on