SN∕T 5185-2020 猪副伤寒检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51852020猪副伤寒检疫技术规范Quarantine protocol for swine paratyphoid2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 51852020I前 言本文件是按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国潍坊海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国合肥海关。本文件主要起草人：张体银、郑腾、田国宁、白泉阳、花群义、宗凯、王武军、张志灯、于师宇。以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 518520201猪副伤寒检疫技术规范1 范围本文件规定了猪副伤寒的临床诊断、病原的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应鉴定技术。本文件适用于猪副伤寒临床诊断和实验室检疫。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB 19489 实验室 生物安全通用要求3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。BSA 牛血清白蛋白（bovine serum albumin）DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate）EB 溴化乙锭（ethidium bromide）ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）HRP 辣根过氧化物酶（horseradish Peroxidase）LPS 脂多糖（lipopolysaccharide）PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid）4 临床诊断4.1 临诊症状4.1.1 急性败血性体温突然升高（41 42 ） ，精神不振，食欲废绝。呼吸困难，耳根、胸前和腹下皮肤有紫红色斑点，后期或有下痢。有时在出现临诊症状后 24 h 内死亡，但多数病程为 2 d4 d，病死率很高。4.1.2 亚急性和慢性病猪体温升高（40.5 41.5 ） ，精神不振，寒颤，喜钻垫草，扎堆，眼有粘性或脓性分泌物，以正式出版文本为准SN/T 518520202少数角膜混浊，严重者发展为溃疡，甚至眼球被腐蚀。病猪食欲不振，初便秘后下痢，粪便淡黄色或黄绿色，恶臭。被毛粗乱，贫血，长期拉稀，粪便含纤维素、坏死组织或饲料凝块。有的皮肤出现弥漫性湿疹。生长发育不良，呈典型僵猪。4.2 病理变化4.2.1 急性型主要为败血症变化。脾常肿大，色暗带有蓝色，坚实似橡皮，脾髓质不软化。肠系膜淋巴结索状肿大，其他淋巴结也有肿大，呈大理石状。肝、肾也有不同程度的肿大、充血和出血，肝实质有时可见黄灰色坏死点。全身黏膜、浆膜均有不同程度的出血斑点，肠胃黏膜可见急性卡他性炎症。4.2.2 亚急性和慢性型主要为坏死性肠炎。盲肠、结肠肠壁增厚，黏膜覆盖一层弥漫性坏死和腐乳状物质，呈糠麸状，底部为红色、边缘不规则的溃疡面。肠系膜淋巴结索状肿胀，部分呈干酪样变。脾肿大。肝有时可见黄灰色坏死点。5 病原的分离和鉴定5.1 仪器和设备5.1.1 培养箱（37 1 和 42 1 ） 。5.1.2 高压灭菌器。5.1.3 玻璃研磨器或组织匀浆机。5.1.4 台式高速离心机。5.1.5 级生物安全柜或者超净工作台。5.1.6 水浴锅。5.1.7 冰箱（2 4 和 20 ） 。5.1.8 无菌吸管。5.1.9 全自动微生物生化鉴定系统。5.2 培养基和试剂5.2.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW） ，配制方法见 A.1。5.2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，配制方法见 A.2。5.2.4 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，配制方法见 A.3。5.2.5 科玛嘉沙门菌属显色培养基琼脂。5.2.6 亚硫酸铋（BS）琼脂，配制方法见 A.4。5.2.7 Hektoen Enteric（HE）琼脂，配制方法见 A.5。5.2.8 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，配制方法见 A.6。5.2.9 胆硫乳（DHL）琼脂，配制方法见 A.7。5.2.10 营养琼脂，配制方法见 A.8。5.2.11 三糖铁（TSI）琼脂，配制方法见 A.9。5.2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基，配制方法见 A.10。5.2.13 蛋白胨水、靛基质试剂，配制方法见 A.11。5.2.14 尿素琼脂（pH 7.2） ，配制方法见 A.12。以正式出版文本为准SN/T 5185202035.2.15 氰化钾（KCN）培养基，配制方法见 A.13。5.2.16 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ONPG）培养基，配制方法见 A.14。5.2.17 丙二酸钠培养基，配制方法见 A.15。5.2.18 革兰氏阴性细菌鉴定卡。5.2.19 沙门菌 O 和 H 诊断血清。5.3 样品采集取样按照 GB/T 18088 的规定执行。无菌采集存活动物的新鲜粪便或直肠棉拭子样品；病死或带菌动物的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织，盲肠扁桃体及肠内容物。5.4 样品保存样品均放入 4 冰箱内保存，并在冷藏状态下 24 h 内送到指定实验室。5.5 细菌分离5.5.1 总则涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 GB/T 19489 要求进行。5.5.2 非污染样品取组织器官和胆囊内容物，无菌条件下选择 2 种选择性琼脂平板（科玛嘉显色培养基琼脂、HE琼脂、XLD 琼脂、DHL 琼脂、BS 琼脂等）进行划线接种培养，同时将组织器官匀浆，1：10 的体积接种 BPW，36 1 培养 18 h24 h，之后再按 1：10 的体积转接 TTB 增菌液和 SC 增菌液，分别于42 1 和36 1 培养24 h 和48 h后，再选择2种同样的选择性琼脂平板划线接种培养，若出现表 1 中的菌落特征，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。如果没有发现可疑菌落，则判定为细菌分离为阴性。表 1沙门菌属在不同琼脂平板上的培养条件和菌落特征培养基种类培养条件沙门菌菌落特征科玛嘉显色培养基琼脂36 1 培养18 h24 h菌落呈淡紫色至紫红色HE 琼脂36 1 培养18 h24 h蓝绿色或蓝色，多数菌落中心为黑色或全黑色；有些菌株为黄色，中心为黑色或几乎全黑色XLD 琼脂36 1 培养18 h24 h菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心DHL 琼脂36 1 培养18 h24 h菌落为无色半透明带有黑色中心，有些菌落中心无黑色沉淀物BS 琼脂36 1 培养40 h48 h菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈现黑色或棕色，有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基颜色不变5.5.3 污染样品将直肠棉拭子、新鲜粪便、盲肠扁桃体、肠内容物等污染样品（非液体性样品最好先制成匀浆液） ，按 1：10 的体积接种 BPW，36 1 培养 18 h24 h，其余步骤同 5.5.2.以正式出版文本为准SN/T 5185202045.6 生化试验5.6.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 1 培养 18 h24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门菌属的反应结果见表 2。表 2沙门菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验初步判断斜面底层产气硫化氢KA+（-）+（-）+可疑沙门菌KA+（-）+（-）-可疑沙门菌AA+（-）+（-）+可疑沙门菌AA+/-+/-非沙门菌KK+/-+/-+/-非沙门菌 注：K ：产碱；A ：产酸；+ ：阳性；- ：阴性；+（-） ：多数阳性，少数阴性；+/- ：阳性或阴性。5.6.2 二次生化试验根据 5.6.1 初步判断结果，从可疑沙门菌对应的营养琼脂平板上挑取菌落分别接种蛋白胨水（供做靛基质试验） 、尿素琼脂（pH7.2） 、氰化钾（KCN）培养基，于 36 1 培养 18 h24 h，必要时可延长至 48 h，个别情况要补做甘露醇和山梨醇试验或 ONPG 试验，按表 3 判定结果。将已挑菌落的营养琼脂平板储存于 2 5 或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。表 3沙门菌属生化反应鉴别表硫化氢（H2 S）靛基质pH7.2 尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶补充试验结果判定+-+ / 沙门菌属+- / 甲型副伤寒沙门菌（要求血清学鉴定结果）+-+ / 沙门菌或（要求血清学鉴定结果）+-+-+ / 沙门菌个别变体（要求血清学鉴定结果）+-+甘露醇试验：+山梨醇试验：+沙门菌属（要求血清学鉴定结果）-+ONPG 试验：-沙门菌属-ONPG 试验：-甲型副伤寒沙门菌（要求血清学鉴定结果） 注： + ：阳性；- ：阴性；/ ：不需要。以正式出版文本为准SN/T 5185202055.6.3 沙门菌生化群鉴定（必要时）根据需要可以选择性进行沙门菌生化群鉴定，见表 4。表 4沙门菌属各生化群的鉴别项目卫矛醇+-+-山梨醇+-水杨苷-+-ONPG-+-+-丙二酸钠-+-KCN-+- 注： + ：阳性；- ：阴性。5.6.4 全自动微生物生化鉴定系统可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据 5.6.1 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.7 血清学试验5.7.1 抗原的准备一般采用 1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 23） 培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查。5.7.2 多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出 2 个约 1 cm2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。5.7.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同 5.7.2。5.8 结果判定生化试验结果与沙门菌属生化特性完全符合时，判定为沙门菌阳性。生化试验沙门菌可疑时，综合生化试验和血清学鉴定结果，若血清学反应 O 抗原或 H 抗原阳性，则判定为沙门菌阳性；若血清学反应 O 抗原和 H 抗原全部阴性，则判定为沙门菌阴性。以正式出版文本为准SN/T 5185202066ELISA 试验6.1 仪器和设备6.1.1 96 孔酶标板。6.1.2 振荡混匀器。6.1.3 洗板机。6.1.4 酶标仪。6.1.5 单道可调微量移液器一套（0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L） 、12 道可调微量移液器（10 L100 L） 。6.1.6 冰箱（2 4 和 20 ） 。6.2 试剂6.2.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。6.2.2 ELISA 标准抗原：肠炎沙门菌 LPS，由指定单位提供。6.2.3 标准阴性血清。6.2.4 标准阳性血清。6.2.5 HRP 标记的抗体。6.2.6 BSA。6.2.7 吐温 -20。6.2.8 0.01 mol/L PBS 缓冲液，配制方法见 A.16。6.2.9 包被液，配制方法见 A.17。6.2.10 洗涤液，配制方法见 A.18。6.2.11 封闭液，配制方法见 A.19。6.2.12 稀释液，配制方法见 A.20。6.2.13 底物溶液，配制方法见 A.21。6.2.14 终止液，配制方法见 A.22。6.3 样品采集制备常规方法采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品 1 周内检测可存放于 2 8 ，超过 1 周应置于 -20 。6.4 操作步骤6.4.1 也可采用其他等效的商业化试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。6.4.2 用包被液将标准抗原稀释至 1 g/mL，将稀释好抗原加入 96 孔酶标板内，每孔加 100 L， 4 包被过夜。6.4.3 每个反应孔加入约 300 L 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸水纸上将酶标板拍干。6.4.4 每孔加封闭液 200 L，37 孵育 1 h。6.4.5 重复步骤 6.4.3。6.4.6 待检血清用稀释液作 1 ：20 稀释，把稀释好的血清加入反应孔内，每孔 100 L ；同时设立阳性血清、阴性血清对照各 2 孔，每孔 100 L。置 37 孵育 1 h。6.4.7 重复步骤 6.4.3。6.4.8 把稀释好的 HRP 标记抗体加入各孔，每孔加 100 L，置室温反应 30 min。以正式出版文本为准SN/T 5185202076.4.9 重复步骤 6.4.3。6.4.10 每孔加入底物溶液 100 L，室温条件下避光孵育 15 min。6.4.11 每孔加 100 L 终止液终止反应，10 min 内以 490 nm 波长测 OD 值。6.5 结果判定6.5.1 判定条件只有当阳性对照平均 OD 值 1.0，阴性对照平均 OD 值 0.20 时，试验成立可进行结果判定；否则重新试验。6.5.2 计算 P/N 值P/N 值计算见式（1） ： P / N =（待检血清平均OD值 - 空白对照平均OD值）（阴性血清平均OD值 - 空白对照平均OD值） （1）6.5.3 判定标准6.5.3.1 P/N 2.0 时，判为待检血清猪副伤寒抗体阳性。6.5.3.2 1.5 P/N 2.0 时，判为可疑。对可疑样品重检一次，重检后若 P/N 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阳性；若 P/N 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。6.5.3.3 P/N 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。7 聚合酶链式反应（PCR）7.1 仪器和设备7.1.1 二级生物安全柜。7.1.2 高速冷冻离心机。7.1.3 水浴锅。7.1.4 PCR 扩增仪。7.1.5 水平电泳仪。7.1.6 凝胶成像仪。7.1.7 微量移液器。7.1.8 高压灭菌锅。7.1.9 冰箱（2 4 和 20 ） 。7.2 试剂7.2.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。7.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW） ，配制方法见 A.1。7.2.3 Taq DNA 聚合酶。7.2.4 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。7.2.5 10PCR 缓冲液。7.2.6 琼脂糖（电泳纯） 。7.2.7 TBE 电泳缓冲液，配制方法见 A.23。7.2.8 上样缓冲液，配制方法见 A.24。7.2.9 DNA 相对分子质量标准品。以正式出版文本为准SN/T 5185202087.2.10 EB，配制方法见 A.25。7.2.11 DNA 纯化回收试剂盒。7.3 引物（Primer）根据肠炎沙门菌 hut 基因序列设计，扩增长度为 495 bp，序列为：上游引物 hut-F ：5- ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA -3下游引物 hut-R ：5- ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG -3引物纯度为 PAGE 级，用 ddH2O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。7.4 质控物质使用肠炎沙门菌标准菌株（ATCC13 076）作为阳性对照；使用不含沙门菌的组织或培养物作为阴性对照；用 ddH2O 作为空白对照。7.5 样品采集同 5.3。7.6 样品的准备将受测细菌单个菌落接种到 10 mL BPW 增菌液内，临床样品（非液体性样品最好先制成匀浆液）按 1：10 的体积接种 BPW，36 1 培养 18 h24 h ；同时制备阳性对照和阴性对照菌株菌液。无菌取 1.5 mL 培养物到灭菌的 EP 管内，12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液，加入 1.5 mL ddH2O水重悬沉淀；12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液，再次加入 1 mL ddH2O 重悬沉淀。7.7DNA 提取将上述菌重悬液在沸水中煮 15 min，10 000 r/min 离心 3 min 沉淀菌体碎片，上清液内即含有细菌基因组 DNA，将上清液转移到干净的离心管内 -20 保存备用。细菌基因组 DNA 的提取也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书要求进行操作。7.8PCR 扩增7.8.1 反应体系在 PCR 中加入 10PCR 缓冲液 2.5 L、5 U/L Taq DNA 聚合酶 0.25 L、10 mol/L 的引物 hutF和 hutR 各 1.0 L、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 L、模板 DNA 2.0 L，补充 ddH2O 至 25 L。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。7.8.2 反应程序94 预变性 5 min ；之后 94 变性 45 s，56 退火 30 s，72 延伸 45 s，共 30 个循环；72 补充延伸 10 min，4 保温。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。7.8.3 琼脂糖凝胶电泳用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 6 L 样品和 2 L 上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标准物 Marker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。以正式出版文本为准SN/T 5185202097.9 凝胶成像分析和测序将电泳完毕的凝胶放入含 0.5 g/mL EB 溶液中染色 10 min30 min 后，在水中漂洗凝胶，用凝胶成像仪观察并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约 495 bp 的 DNA 片段，应切胶回收DNA 片段进行测序，参考序列参见 B.1。7.10 结果判定经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约 495 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无条带时，试验成立。 待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳性。无条带或条带的大小不是 495 bp 的为阴性。8 实时荧光 PCR8.1 仪器和设备8.1.1 二级生物安全柜。8.1.2 高速冷冻离心机。8.1.3 水浴锅。8.1.4 荧光 PCR 仪。8.1.5 微量移液器。8.1.6 高压灭菌锅。8.1.7 冰箱（2 4 和 20 ） 。8.2 试剂8.2.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。8.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW） ，配制方法见 A.1。8.2.3 10PCR 缓冲液。8.2.4 Taq DNA 聚合酶。8.2.5 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。8.3 引物和探针根据肠炎沙门菌 ttrBCA 基因序列设计，扩增长度为 95 bp，引物序列为：上游引物 F ：5- AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC -3下游引物 R ：5- CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG -3引物纯度为 HPLC 级，用 ddH2O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。探针序列为 FAM CAC CGA CGG CGA GAC CGA CTT T TAMRA。用 ddH2O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。8.4 质控物质使用肠炎沙门菌标准菌株（ATCC13 076）作为阳性对照；使用不含沙门菌的组织或培养物作为阴性对照；用 ddH2O 作为空白对照。8.5 样品采集同 5.3。以正式出版文本为准SN/T 51852020108.6 样品的准备同 7.6。8.7DNA 提取同 7.7。8.8 实时荧光 PCR 扩增8.8.1 反应体系反应总体积为 25 L，其中 10PCR 缓冲液 2.5 L、5 U/L Taq DNA 聚合酶 0.5 L、10 mmol/L dNTPs 0.5 L、10 mol/L 的引物 F 和 R 各 1.0 L、10 mol/L 的探针 1.0 L、模板 DNA 2.0 L，补充ddH2O 至 25 L。实时荧光 PCR 扩增可以采用等效的商品化荧光定量 PCR 试剂盒。8.8.2 反应程序95 预变性 5 min ；之后 95 变性 15 s，65 退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。8.9 结果判断综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM 通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 Ct 值 30 ；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且 Ct值 40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。检验样本 Ct 值 35 时，报告沙门菌阳性。检验样本 35 Ct 值 40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然 40，并且曲线有明显的对数增长期，报告沙门菌阳性；否则报告沙门菌阴性。样本 Ct 值为零或 Ct 值 40 时，报告未检出沙门菌。以正式出版文本为准SN/T 5185202011附录A （规范性） 试剂的配制A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）蛋白胨10 g氯化钠5 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 9 g磷酸二氢钾（KH2PO4 ） 1.5 g蒸馏水1 000 mLpH 7.00.2 将各成分加入蒸馏水中，搅拌混匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，121 高压灭菌 15 min。A.2 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液蛋白胨5.0 g乳糖4.0 g磷酸氢二钠10.0 g亚硒酸氢钠4.0 gL- 胱氨酸0.01 g蒸馏水1 000 mLpH 7.00.2除亚硒酸氢钠和 L- 胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 1 g / L L- 胱氨酸溶液 10 mL（称取 0.1 g L- 胱氨酸，加 1 mol / L 氢氧化钠溶液 15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成，如为 DL- 胱氨酸，用量应加倍） 。摇匀，调节 pH。A.3 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液A.3.1 基础液蛋白胨10.0 g牛肉膏5.0 g氯化钠3.0 g碳酸钙45.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.00.2除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH，121 高压灭菌 20 min。A.3.2 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含 5 个结晶水） 50.0 g以正式出版文本为准SN/T 5185202012蒸馏水加至 100 mL121 高压灭菌 20 min。A.3.3 碘溶液碘片20.0 g碘化钾25.0 g蒸馏水加至 100 mL将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻璃瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.3.4 0.5煌绿水溶液煌绿0.5 g蒸馏水100 mL溶解后，存放暗处，不少于 1 d，使其自然灭菌。A.3.5 牛胆盐溶液牛胆盐10.0 g蒸馏水100 mL加热煮沸至完全溶解，121 高压灭菌 20 min。A.3.6 制法基础液900 mL硫代硫酸钠溶液100 mL碘溶液20.0 mL煌绿水溶液2.0 mL牛胆盐溶液50.0 mL临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。A.4 亚硫酸铋（BS）琼脂A.4.1 成分蛋白胨10.0 g牛肉膏5.0 g葡萄糖5.0 g硫酸亚铁0.3 g磷酸氢二钠4.0 g煌绿0.025 g 或 5.0 g/L 水溶液 5.0 mL柠檬酸铋铵2.0 g亚硫酸钠6.0 g琼脂18.0 g20 g蒸馏水1 000 mLpH 7.50.2以正式出版文本为准SN/T 5185202013A.4.2 制法将前 3 种成分加入 300 mL 蒸馏水（制作基础液） ，硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，琼脂加入 600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至 50 55 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h 会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.5 Hektoen Enteric（HE）琼脂A.5.1 成分蛋白胨12.0 g牛肉膏3.0 g乳糖12.0 g蔗糖12.0 g水杨素2.0 g胆盐20.0 g氯化钠5.0 g琼脂18.0 g20.0 g蒸馏水1 000 mL0.4溴麝香草酚蓝溶液16.0 mLAndrade 指示剂20.0 mL甲液 20.0 mL乙液 20.0 mLpH 7.50.2A.5.2 制法将前面 7 种成分溶解于 400 mL 蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于 600 mL 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节 pH 再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至 50 55 倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。甲液的配制。硫代硫酸钠34.0 g柠檬酸铁铵4.0 g蒸馏水100 mL乙液的配制。去氧胆酸钠10.0 g蒸馏水100 mL Andrade 指示剂。酸性复红0.5 g1 mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 mL蒸馏水100 mL以正式出版文本为准SN/T 5185202014将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液 1 mL2 mL。A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂A.6.1 成分酵母膏3.0 gL- 赖氨酸5.0 g木糖3.75 g乳糖7.5 g蔗糖7.5 g去氧胆酸钠2.5 g柠檬酸铁铵0.8 g硫代硫酸钠6.8 g氯化钠5.0 g琼脂15.0 g酚红0.08 g蒸馏水1 000 mLpH 7.40.2A.6.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 55 倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.7 胆硫乳（DHL）琼脂A.7.1 成分蛋白胨20.0 g牛肉浸膏3.0 g乳糖10.0 g蔗糖10.0 g去氧胆酸钠1.0 g硫代硫酸钠2.3 g柠檬酸钠1.0 g柠檬酸铁铵1.0 g中性红1.0 g琼脂18.020.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.3以正式出版文本为准SN/T 5185202015A.7.2 制法将除中性红和琼脂以外的成分溶解于 400 mL 蒸馏水中，校正 pH，再将琼脂于 600 mL 蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入 0.5% 中性红溶液 6 mL，冷却至 50 55 ，倾注平皿。A.8 营养琼脂营养琼脂干粉28.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.0将上述成分煮沸溶解，校正 pH，分装至小试管中，121 高压灭菌 15 min 后，置成斜面，冷藏备用。A.9 三糖铁（TSI）琼脂A.9.1 成分蛋白胨20.0 g牛肉膏5.0 g乳糖10.0 g蔗糖10.0 g葡萄糖1.0 g硫酸亚铁铵（含 6 个结晶水） 0.2 g酚红 0.025 g 或 5.0 g/L 溶液 5.0 mL氯化钠5.0 g硫代硫酸钠0.2 g琼脂12.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.40.2A.9.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管 2 mL4 mL，121 高压灭菌10 min 或 115 高压灭菌 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。A.10 赖氨酸脱羧酶试验培养基A.10.1 成分蛋白胨5.0 g酵母浸膏3.0 g葡萄糖1.0 g蒸馏水1 000 mL1.6溴甲酚紫 - 乙醇溶液1.0 mL以正式出版文本为准SN/T 5185202016L- 赖氨酸或 DL- 赖氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mLpH 6.80.2A.10.2 制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。L- 赖氨酸按 0.5加入， DL- 赖氨酸按 1加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，115 高压灭菌 10 min。A.10.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 1 培养 18 h24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A.11 蛋白胨水、靛基质试剂A.11.1 蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g氯化钠5.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.40.2将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH，分装小试管，121 高压灭菌 15 min。A.11.2 靛基质试剂A.11.2.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。A.11.2.2 欧 - 波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。A.11.3 试验方法挑取小量培养物接种，在 36 1 培养 1 d2 d，必要时可培养 4 d5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧 - 波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。A.12 尿素琼脂（pH 7.2）A.12.1 成分蛋白胨1.0 g氯化钠5.0 g葡萄糖1.0 g磷酸二氢钾2.0 g0.4酚红3.0 mL琼脂20.0 g蒸馏水1 000 mL20% 尿素溶液100 mL以正式出版文本为准SN/T 5185202017pH 7.20.2A.12.2 制法除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121 高压灭菌 15 min。冷至 50 55 ，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2。分装于无菌试管内，放成斜面备用。A.12.3 试验方法挑取琼脂培养物接种，在 36 1 培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。A.13 氰化钾（KCN）培养基A.13.1 成分蛋白胨10.0 g氯化钠5.0 g磷酸二氢钾0.225 g磷酸氢二钠5.64 g蒸馏水1 000 mL0.5氰化钾20.0 mLA.13.2 制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 高压灭菌 15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5氰化钾溶液 2.0 mL（最后浓度为 1：10 000） ，分装于无菌试管内，每管约 4 mL，立刻用无菌橡皮塞塞紧，放在 4 冰箱内，至少可保存 2 个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。A.13.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1 环接种于对照培养基。 在36 1 培养1 d2 d，观察结果。 如有细菌生长即为阳性 （不抑制） ，经 2 d 细菌不生长为阴性（抑制） 。注：氰化钾是剧毒药，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。A.14 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ONPG）培养基牛肉膏0.3 g蛋白胨1.0 g氯化钠0.5 g琼脂0.35 g0.4 g蒸馏水100 mLpH 7.40.2以正式出版文本为准SN/T 5185202018按以上成分配好，煮沸溶解，调节 pH。分装小试管。121 高压灭菌 15 min。直立凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。A.15 丙二酸钠培养基A.15.1 成分酵母浸膏1.0 g硫酸铵2.0 g磷酸氢二钾0.6 g磷酸二氢钾0.4 g氯化钠2.0 g丙二酸钠3.0 g0.2溴麝香草酚蓝溶液12.0 mL蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2A.15.2 制法除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH，再加入指示剂，分装试管，121 高压灭菌 15 min。A.15.3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于 36 1 培养 48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。A.16 0.01 mol/L PBS 缓冲液 NaCl8.50 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gNa2HPO412H202.89 g蒸馏水1 000 mL充分溶解并调整 pH 值后，121 高压蒸汽灭菌 15 min。A.17 包被液（0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液，pH9.6）碳酸氢钠 2.93 g，碳酸钠 1.59 g，双蒸水加至 1 000 mL，2 8 保存备用，1 周内用完。A.18 洗涤液（0.01 mol/L PBST，pH7.4）吐温 -20 0.50 mL，加 0.01 mol/L PBS 至 1 000 mL，现用现配。A.19 封闭液（含 10% 胎牛血清的 PBST）胎牛血清10 mLPBS100 mL以正式出版文本为准SN/T 5185202019充分混匀后，置于 4 冰箱内避光保存备用。A.20 稀释液PBS-T 100 mL，牛血清白蛋白（BSA） 2.0 g，混匀。A.21 底物溶液A液：称取21 g柠檬酸 （C6H8O7 H2O） 加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，配置成0.1 mol/L柠檬酸。B 液：称取 71.6 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）加蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL，配制成 0.2 mol/L 磷酸氢二钠。取 A 液 24.3 mL、B 液 25.7 mL，混合后加入 20 mg 邻苯二胺（OP