别孕烯醇酮对老年雄性小鼠术后谵妄的防治作用及其机制.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 30 期别孕烯醇酮对老年雄性小鼠术后谵妄的防治作用及其机制李月1，杨建新2，王彬1，吉郝斌1，孟治寿2，程子健31 山西医科大学麻醉学院，太原030000；2 山西医科大学第二医院疼痛科；3 山西医科大学第二医院麻醉科摘要：目的观察别孕烯醇酮（Allopregnanolone，Allo）腹腔皮下注射对老年雄性小鼠术后谵妄（POD）的防治作用，并探讨其可能作用机制。方法96只6月龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为A、B、C组及对照组（各24只）：对照组小鼠正常饲养，A、B、C组小鼠行右下肢胫骨骨折内固定术（常用POD动物模型制备方法），A组小鼠术后1 小时腹腔注射别孕烯醇酮8 mg/kg，术后第6、24、48小时分别皮下注射8 mg/kg的别孕烯醇酮，B组小鼠术后1 小时腹腔注射等体积溶剂2-羟丙基-环糊精，术后第6、24、48小时分别皮下注射等体积溶剂2-羟丙基-环糊精，C组小鼠术后未予任何药物。分别于术前及术后第1、3、7天采用Morris水迷宫实验评估小鼠空间学习和记忆能力，测试结束后各组随机处死6只小鼠，取海马组织检测各组小鼠海马组织炎性因子及磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）、核因子B（NF-B）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）通路相关蛋白。结果与对照组比较，术后第1、3、7天C组小鼠逃避潜伏期长、平台穿越次数少（P均0.05）；与C组比较，术后第1、3、7天A组小鼠逃避潜伏期短、平台穿越次数多（P均0.05）。与对照组比较，术后第 1、3、7天 C组小鼠海马组织肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素1（IL-1）、p-p38MAPK、NF-B、NLRP3相对表达量高（P均0.05）；与C组比较，术后第1、3、7天A组小鼠海马组织TNF-、IL-1、p-p38MAPK、NF-B、NLRP3相对表达量低（P均0.05）。结论别孕烯醇酮腹腔及皮下注射可减轻老年雄性小鼠右下肢胫骨骨折内固定术后POD，海马组织TNF-、IL-1、p-p38MAPK、NF-B、NLRP3表达低，其机制可能为别孕烯醇酮可抑制海马组织TNF-、IL-1、p-p38MAPK、NF-B、NLRP3表达。关键词：别孕烯醇酮；围手术期神经认知功能障碍；术后谵妄；肿瘤坏死因子；白细胞介素1；p38丝裂原活化蛋白激酶；核因子B；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.012 中图分类号：R614 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）30-0053-05Preventive and therapeutic effect of allopregnenolone on postoperative delirium in aged male mice and its mechanismLI Yue1，YANG Jianxin，WANG Bin，JI Haobin，MENG Zhishou，CHENG Zijian1 College of Anesthesia，Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China开放科学（资源服务）标识码（OSID）6葛晨，付优，刘俊行，等.微小RNA-21对脓毒症急性肺损伤肺组织的修复作用及其与PTEN的关系 J.山东医药，2022，62（2）：30-34.7DONG W W，LUO B，QIU C，et al.TRIM3 attenuates apoptosis in Parkinsons disease via activating PI3K/AKT signal pathway J.Aging（Albany NY），2020，13（1）：735-749.8ZHAO J，LI X，ZOU M，et al.miR-135a inhibition protects A549 cells from 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apoptosis in alveolar epithelial cells via regulating phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B activation J.Bioengineered，2022，13（1）：155-163.（收稿日期：2023-06-16）53山东医药2023 年第 63 卷第 30 期基金项目：山西省科学技术厅面上自然基金项目；山西省卫生健康委员会科研课题项目。通信作者：杨建新（E-mail：）Abstract：Objective To observe the preventive and therapeutic effect of intraperitoneal and subcutaneous injection of allopregnanolone（Allo）on postoperative delirium（POD）in aged male mice and to explore its possible mechanism.Methods Ninety-six 6-month-old male C57BL/6J mice were randomly divided into groups A，B，C and control group，with 24 in each.Mice in the control group were fed normally，and mice in the groups A，B and C underwent internal fixation of tibial fracture of right lower limb（POD animal model preparation method is commonly used）.Mice in the group A were intraperitoneally injected with 8 mg/kg allopregnenolone at 1 h after surgery，and then were subcutaneously injected with 8 mg/kg allopregnenolone at 6，24 and 48 h after surgery，respectively.Mice in the group B were intraperitoneally injected with 2-hydroxypropyl-cyclodextrin at 1 h after surgery，and subcutaneously injected with 2-hydroxypropyl-cyclodextrin at 6，24 and 48 h after surgery，respectively.Mice in the group C were not given any drugs after surgery.Morris water maze test was used to evaluate the spatial learning and memory ability of mice before surgery and at the 1，3 and 7 days after surgery，respectively.After the test，six mice were randomly killed in each group.Hippocampal tissues were taken to detect inflammatory factors and phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase（p-p38MAPK），nuclear factor B（NF-B），and NOD-like receptor protein 3（NLRP3）pathway-related proteins in the hippocampal tissues of mice in each group.Results Compared with the control group，the escape latency of mice in group C was longer and the number of platform crossing was smaller on the 1st，3rd and 7th days after operation（all P0.05）.Compared with the group C，the escape latency of mice in the group A was shorter and the number of platform crossing was lager on day 1，3 and 7 after operation（all P0.05）.Compared with the control group，the expression levels of tumor necrosis factor-（TNF-），interleukin-1（IL-1），p-p38MAPK，NF-B，and NLRP3 in the hippocampal tissues of group C were higher on day 1，3 and 7 after surgery（all P0.05）.Compared with the group C，the expression levels of TNF-，IL-1，p-p38MAPK，NF-B and NLRP3 in the hippocampal tissues of the group A were lower on day 1，3 and 7 after surgery（all P0.05）.Conclusion Intraperitoneal and subcutaneous injection of allopregnenolone can reduce POD after internal fixation of tibial fracture of right lower limb in aged male mice probably by inhibiting the expression levels of TNF-，IL-1，p-p38MAPK，NF-B，and NLRP3 in the hippocampal tissues.Key words：allopregnanolone；perioperative neurocognitive disorders；postoperative delirium；tumor necrosis factor-；interleukin-1；p38 mitogen-activated protein kinase；nuclear factor-B；NOD-like receptor protein 3围手术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorders，PND）是围手术期一种常见的并发症，可引起患者术后人格、社交和认知能力的改变，如反应迟钝、注意力不集中、记忆及学习能力受损等1-2。根据认知障碍发生的时间可将PND分为术前存在的认知功能障碍（NCD）、术后谵妄（POD）、神经 认 知 延 迟 恢 复（DNR）及 术 后 神 经 认 知 障 碍（POCD），其中POD指术后1周或患者出院前发生的神经认知障碍3。POD的发病机制目尚前不清楚，相关研究主要围绕中枢及外周炎症、神经元自噬、A蛋白沉积及tau蛋白过度磷酸化、线粒体能量代谢异常等。NLR受体是免疫细胞表达于胞质内模式识别受体（PRRs）亚群之一，其中 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）是NLR受体家族中已知的唯一可被致病和无菌炎症信号通路间接激活的成员4。p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是核因子B（NF-B）的上游分子，NF-B信号通路可通过上调NLRP3蛋白表达，促进连接蛋白ASC和效应蛋白半胱天冬酶-1（caspase-1）表达，介导白细胞介素 1（IL-1）、IL-18 的成熟释放，提高炎症反应程度5。别孕烯醇酮是一种内源性神经甾体激素。研究6-7发现，随年龄增长，小鼠海马组织别孕烯醇酮表达降低，外源性补充别孕烯醇酮可逆转阿尔兹海默症小鼠海马组织中 A 沉积引起的神经认知障碍。别孕烯醇酮是否可改善老年雄性小鼠胫骨骨折内固定术后 POD 程度目前尚无相关研究报道。2022年9月2023年7月，我们观察了别孕烯醇酮腹腔及皮下注射的老年雄性小鼠胫骨骨折内固定术后POD发生情况，探讨其可能作用机制，现将结果报告如下。1 材料与方法 1.1动物、试剂及仪器1 月龄老年雄性小鼠C57BL/6J 小鼠 96 只，体质量（13 3）g，购于山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（晋）54山东医药2023 年第 63 卷第 30 期2019-0004，动物饲养 5个月后进行实验，动物伦理经山西医科大学第二医院医院动物伦理委员会批准（动物伦理委员会编号：DW2023030）。别孕烯醇酮（生产批号：B7456）购于美国 Apexbio 公司；2-羟丙基-环糊精试剂（生产批号：ST2114）购于碧云天生物技术公司；小鼠ELISA检测试剂盒 IL-、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF-）、p-p38MAPK、NLRP3、NF-B（生产批号：MM-0040M1、MM-0132M1、MM-1209M2、MM-0656M2、MM-44130M1）均购于江苏酶免实业有限公司。1.2动物分组、POD模型制备及别孕烯醇酮给予方法96只 6月龄小鼠随机分为 A、B、C组及对照组（各 24 只）：A、B、C 组小鼠参照相关文献，建立胫骨骨折内固定术小鼠 POD 模型8（常用 POD 动物模型制备方法），对照组小鼠不作任何处理，正常饲养。小鼠 POD 模型制备9方法：3%5%七氟烷和 29%的 FiO2全身麻醉小鼠，维持剂量 2%3%，小鼠翻正反射消失后固定鼠身，于小鼠右胫骨前方备皮、消毒，沿胫骨前缘、膝关节下方切开0.51.0 cm 纵行切口，小心分离胫骨上 1/3 处周围血管、肌肉、筋膜，在髓内腔内插入一根直径为0.53（25G）mm 针，去除暴露在外的髓内针，后用锯片横向将胫骨骨干锯断，骨折后用无菌生理盐水冲洗并缝合伤口，于切口处涂抹林可霉素利多卡因凝胶（术后镇痛及抗感染治疗），将液体敷料抹于伤口（防止伤口被污染），即完成胫骨骨折内固 定 术。术 毕 三 组 小 鼠 腹 腔 注 射 250 g/kg的 LPS，停止七氟烷吸入，加大氧流量，小鼠苏醒后放回笼中，常规给予水和饲料，维持环境温度。A 组 小 鼠 术 后 第 1 小 时 腹 腔 注 射 别 孕 烯 醇 酮8 mg/kg，术后第 6、24、48小时分别皮下注射8 mg/kg的别孕烯醇酮；B组小鼠术后第1 小时腹腔注射等体积溶剂 2-羟丙基-环糊精，术后第 6、24、48 小时分别皮下注射等体积溶剂 2-羟丙基-环糊精；C 组小鼠术后未给予任何药物干预。各组术后常规给予水和饲料，小鼠分笼饲养，12 h昼夜交替环境，温度（21 2），湿度 5060%，定期环境通风与紫外线消毒。1.3各组小鼠神经认知功能检测方法分别于术前及术后第1、3、7天采用Morris水迷宫实验评估小鼠空间学习和记忆能力（代表小鼠神经认知功能）。水迷宫分为NE、NW、SE、SW四个象限，水池温度控制在2224。该实验分训练阶段和实验阶段。训练阶段记录小鼠找到平台所花费的时间（逃避潜伏期）。实验阶段记录术前及术后第1、3、7天四个象限的小鼠逃避潜伏期，并取平均值。术后第7天测算完各组小鼠逃避潜伏期后，撤去平台，选择平台对面象限及任一象限释放小鼠，各象限限时60 s，观察并记录小鼠在目标象限平台区域穿越次数，即为平台穿越次数。1.4各组小鼠海马组织炎性因子及NLRP3相关信号通路蛋白检测分别于术前及术后第 1、3、7 天水迷宫行为学测试结束2 h时各组随机处死6只小鼠，断头后取海马组织，采用 ELISA 法检测各组小鼠海马组织 TNF-、IL-1、p-p38MAPK、NF-B 及NLRP3。取各组小鼠海马组织，称重、依次加入PBS缓冲液，PMSF试剂抑制蛋白酶，组织剪剪碎、超声粉碎机粉碎、离心、收集上清液，BCA法测定上清液蛋白浓度，所有操作均严格按照 ELISA 试剂盒说明 进 行，绘 制 标 准 曲 线，测 算 TNF-、IL-1、p-p38MAPK、NF-B及NLRP3相对表达量。重复测算3次，取平均值。1.5统计学方法采用SPSS25.0统计软件进行数据处理。采用 Shapiro-Wilk 法行正态性检验，符合正态分布的计量资料以x s表示，两组均数比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素 ANOVA 方差分析，组间两两事后比较用LSD法。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组小鼠逃避潜伏期及平台穿越次数比较术前及术后第1、3、7天各组小鼠逃避潜伏期比较见表1。A组、B组、C组及对照组小鼠术后第7天平 台 穿 越 次 数 分 别 为（3.06 1.05）、（1.86 0.75）、（1.86 1.00）、（6.23 0.83）次。与对照组比较，A、B、C组小鼠术后第7天平台穿越次数少（P均0.05）；P与B、C组比较，A组术后第7天平台穿越次数多（P均0.05）。表1术前及术后第1、3、7天各组小鼠逃避潜伏期比较（s，-x s）组别A组B组C组对照组逃避潜伏期术前40.17 4.8340.66 5.9940.18 3.5441.02 3.61术后第1天47.29 3.42*#51.93 1.52*53.72 4.05*35.06 5.31术后第3天36.21 6.49*#46.13 2.74*46.30 1.37*28.96 6.55术后第7天25.83 4.20#34.19 6.95*36.90 5.56*22.49 7.11注：与对照组比较，*P0.05；与 C 组比较，#P0.05；与 B 组比较，P0.05。55山东医药2023 年第 63 卷第 30 期2.2各组小鼠海马组织 IL-1 及 TNF-相对表达量比较术前A、B、C及对照组小鼠海马组织IL-1相对表达量分别为 19.33 1.29、21.15 2.27、19.20 1.84、19.41 1.55，术后第1天A、B、C及对照 组 小 鼠 海 马 组 织 IL-1 相 对 表 达 量 分 别 为43.01 1.41、51.45 2.28、49.69 3.59、20.38 1.88，术后第 3 天 A、B、C 及对照组小鼠海马组织IL-1 相对表达量分别为 33.88 2.44、44.02 1.76、44.55 2.62、21.68 1.31，术后第7天A、B、C及对照组小鼠海马组织IL-1相对表达量分别为27.89 2.84、40.34 2.98、39.67 2.30、18.68 2.11。与对照组比较，术后第1、3、7天A、B、C组小鼠海马组织 IL-1相对表达量高（P均0.05）；与 C组比较，术后第1、3、7天A组小鼠海马组织IL-1相对表达量低（P均0.05）；与B组比较，术后第1、3、7天 A 组小鼠海马组织 IL-1 相对表达量低（P 均0.05）。术前及术后第1、3、7天各组小鼠海马组织TNF-相对表达量比较见表2。2.3各组小鼠海马组织 p-p38MAPK、NF-B、NLRP3蛋白相对表达量比较术前A、B、C及对照组小鼠海马组织p-P38MAPK相对表达量分别为34.24 2.09、33.35 1.59、35.08 2.72、32.73 1.94，术后第1天A、B、C及对照组小鼠海马组织p-P38MAPK相对表达量分别为 60.27 4.19、66.83 5.87、66.98 3.84、33.97 3.26，术后第3天A、B、C及对照组小鼠海马组织p-P38MAPK相对表达量分别为54.15 2.31、60.91 1.93、59.40 2.70、35.09 2.04，术后第 7 天 A、B、C 及对照组小鼠海马组织p-P38MAPK 相 对 表 达 量 分 别 为 45.98 1.97、54.67 3.93、53.27 2.53、34.17 2.02。与对照组比较，术后第1、3、7天A、B、C组小鼠海马组织p-P38MAPK 相对表达量高（P 均0.05）；与 C 组比 较，术 后 第 1、3、7 天 A 组 小 鼠 海 马 组 织p-P38MAPK相对表达量低（P均0.05）；与B组比较，术后第1、3、7天A组小鼠海马组织p-P38MAPK相对表达量低（P均0.05）。术前及术后第1、3、7天各组小鼠海马组织NF-B、NLRP3相对表达量比较见表3、4。3 讨论 围术期神经认知障碍的发病机制较多研究围绕中枢炎症展开研究，大脑是具有免疫功能的器官，星形胶质细胞、内皮细胞支持着血脑屏障的完整性，手术创伤后对机体的损伤引起损伤相关模式分子（DAMP）介质的快速释放，进而激活先天免疫系统，致使TNF-、IL-1等炎性因子的合成释放入血，破坏血脑屏障进入中枢神经系统，激活小胶质细胞进一步释放炎性因子TNF-、IL-1，引起中枢炎症和神经功能障碍。炎性因子TNF-及IL-1在炎症级联反应的启动和放大中起关键作用，参与氧化应激、细胞凋亡、修复等机制，高水平的IL-1还可干扰长表2术前及术后第1、3、7天各组小鼠海马组织TNF-相对表达量比较（ng/L，-x s）组别A组B组C组对照组TNF-术前105.46 11.20105.46 11.20101.83 9.81107.76 12.11术后第1天250.78 13.40*250.78 13.40*247.61 25.00*100.37 9.35术后第3天224.12 13.26*224.12 13.26*221.84 22.03*104.13 12.40术后第7天191.61 19.06*191.61 19.06*188.57 11.79*100.94 12.13注：与对照组比较，*P0.05；与 C 组比较，#P0.05；与 B 组比较，P0.05。表3术前及术后第1、3、7天各组小鼠海马组织NF-B相对表达量比较（ng/L，-x s）组别A组B组C组对照组NF-B术前1 354.57 142.451 318.28 100.531 425.26 90.251 365.45 73.24术后第1天2 995.32 193.87*#3 494.79 149.74*3 403.92 234.20*1 445.04 107.76术后第3天2 345.76 192.67*#2 941.50 151.53*2 909.83 203.04*1 333.37 164.92术后第7天1 940.22 158.39*#2 521.98 75.39*2 501.69 213.46*1 327.99 129.96注：与对照组比较，*P0.05；与C组比较，#P0.05；与B组比较，P0.05。表4术前及术后第1、3、7天各组小鼠海马组织NLRP3相对表达量比较（pg/mL，-x s）组别A组B组C组对照组NLRP3术前88.43 14.6986.69 16.2786.73 11.9289.56 12.16术后第1天222.88 22.22*#259.22 35.43*258.93 34.31*87.99 12.67术后第3天185.59 12.59*#217.80 13.65*228.48 14.33*85.88 10.55术后第7天127.46 11.49*#173.25 13.46*170.87 16.60*88.07 18.75注：与对照组比较，*P0.05；与C组比较，#P0.05；与B组比较，P0.05。56山东医药2023 年第 63 卷第 30 期时程增强和突触可塑性，进而影响学习及记忆能力。别孕烯醇酮是一种内源性神经甾体激素，通常由中枢的神经胶质细胞和神经元合成，经外周血运，透过血脑屏障在中枢发挥作用10。别孕烯醇酮是一种作用于GABA-A受体的正性变构调节剂，可通过增加GABA与受体结合发挥作用11。有研究12表明GABA 可抑制 NF-B 和 p38MAPK 激酶等途径诱导的炎症反应。p38 MAPK引起炎症反应、细胞凋亡、细胞分化等多种生物反应13；NF-B 作为p38MAPK通路的下游分子，同时也是参与小胶质细胞M1激活的关键调节因子，可被磷酸化的p38MAPK激活入核，正反馈促进多种炎症因子的合成释放，诱发中枢炎症反应，造成神经元受损，脑功能异常13。NF-B通路的激活可上调 NLPR3 蛋白等物质合成，促进NLRP3 炎症小体进行组装和激活14。NLRP3 与PND的进展相关。ZHANG等15研究发现，右美托咪定能够通过泛自噬途径促进NLRP3炎症小体的降解，减轻中枢炎症及神经元损伤，改善了小鼠围术期认知障碍的发生。而NLRP3阻断剂MCC950则是通过阻断NLRP3、ASC和caspase-1复合物的组装和形成来改善术后认知功能障碍；此外衰老过程中的一些炎性介质、代谢物等也会启动增强NLRP3炎症小体反应，进一步驱动炎症反应和疾病发展。海马在空间学习和情景记忆中起着关键作用，其中皮层1区（CA1）、CA3和齿状回（DG）区域参与了空间导航和情景记忆的形成16。本研究结果发现，与对照组相比，其余各组术后小鼠的逃避潜伏期均有所延长，术后第7天平台穿越次数减少，活动轨迹分散，反映了小鼠术后学习记忆能力的下降，与之相一致，小鼠海马组织炎性因子水平也显著升高；而A组小鼠术后水迷宫中的表现明显优于C组，海马组织炎性因子表达下降，提示别孕烯醇酮可改善小鼠术后的学习及记忆能力；此外，本研究对小鼠海马组织NLRP3及其上游p-p38MAPK、NF-B的表达进行了定量分析，这三种蛋白作为炎性反应的参与者，在促进炎性因子的合成释放中发挥着重要作用，本研究结果示，与对照组相比，其余进行手术的三组小鼠术后海马组织中p-p38MAPK、NF-B、NLRP3表达均升高，而A组小鼠经过别孕烯醇酮干预后，其海马组织p-p38MAPK、NF-B、NLRP3 的 表 达 较 C 组 明 显降低。综上所述，别孕烯醇酮可抑制中枢炎症反应，改善小鼠胫骨骨折内固定术后谵妄引起的认知功能受损，其机制可能与通过抑制海马组织 p38 MAPK/NF-B/NLRP3 信号通路中相关蛋白表达有关。参考文献：1赵雨帆，欧阳文，胡中华，等.老年患者围术期神经认知障碍与术后急性疼痛的研究进展 J.临床麻醉学杂志，2021，37（5）：542-545.2周建雄，胥明哲，王蕊，等.老年患者术后谵妄的研究进展J.临床麻醉学杂志，2019，35（9）：920-924.3EVERED L，SILBERT B，KNOPMAN D S，et al.Recommendations for the Nomenclature of Cognitive Change Associated with Anaesthesia and Surgery-2018 J.Br J 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