SN∕T 4876.8-2020 DNA条形码方法 第8部分：菟丝子属(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4876.82020代替 SN/T 11622002DNA 条形码方法第 8 部分：菟丝子属Method for DNA barcoding Part 8: Cuscuta spp. 中华人民共和国海关总署发 布ICS 65.020.01CCS B 162020-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 4876.82020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。SN/T 4876DNA 条形码方法为系列标准，已发布以下部分：第 1 部分：检疫性乳白蚁第 2 部分：检疫性断眼天牛第 3 部分：检疫性卷蛾第 4 部分：检疫性高梁属第 5 部分：曼陀罗属第 6 部分：瘤背豆象属第 7 部分：一品红亚属第 8 部分：莬丝子属本文件为 SN/T 4876 的第 8 部分本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位： 中华人民共和国福州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国宁波海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国南京海关。本文件主要起草人： 于文涛、印丽萍、王念武、虞赟、傅怡宁、徐瑛、范晓虹、邵秀玲、吴海荣、薛华杰、伏建国。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 4876.82020DNA 条形码方法菟丝子属1范围本文件规定了菟丝子属的 DNA 条形码检测鉴定方法。本文件适用于国境口岸开展菟丝子属分子鉴定的植物检疫实验室。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 1385菟丝子属的检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码DNA barcode一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化，并容易进行 PCR 扩增。DNA 条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2凭证标本voucher specimen 一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本记录的存档信息应具有追溯性。凭证标本的保存非常重要，是 DNA 条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。3.3核基因组核糖体 DNAnuclear ribosome DNA；nrDNA真核生物细胞核染色体所包含的全部遗传信息，即碱基对，有别于诸如叶绿体和线粒体的质体DNA，以及黏粒及质粒等其他 DNA 存在形式。3.4叶绿体 DNAchloroplast DNA；cpDNA存在于叶绿体内的 DNA。高等植物叶绿体的 DNA 为双链共价闭合环状分子，其长度因生物种类而不同，其大小在 120 kb 到 217 kb 之间，相当于噬菌体基因组的大小。3.5内部转录间隔区internal transcribed spacer；ITS在真核生物核核糖体 DNA 中，18S rRNA 和 28S rRNA 基因间隔序列称为内转录间隔区。内转录间隔区所在的核糖体基因组序列从 5 到 3 依次为：外部转录间隔区（external transcribed spacer，ETS） 、18S 基因、内部转录间隔区 1（ITS1） 、5.8S 基因、内部转录间隔区 2 （ITS2） 、28S 基因和基因间隔序列（intergenic spacer，IGS） 。即，内转录间隔区包含 ITS1、5.8S 基因和 ITS2。核糖体 RNA 中以正式出版文本为准2SN/T 4876.82020的 18S、5.8S 和 28S 的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS1 和 ITS2 作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。3.61,5 - 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因RubisCo_large ； rbcL1,5 - 二磷酸核酮糖羧化酶（ RubisCo）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起着重要的作用。RubisCo 酶由 16 个亚基组成，包括 8 个大亚基和 8 个小亚基。其中大亚基基因（rbcL）由叶绿体基因组编码。4菟丝子属植物基本信息中文名：菟丝子属学名：Cuscuta spp.分类地位：被子植物门（Magnoliophyta） ，木兰纲（Magnoliatae） ，茄目（Solanales） ，旋花科（Convolvulaceae）菟丝子属植物为寄生草本，无根，全体不被毛。茎缠绕，细长，线形，黄色或红色，不为绿色，借助吸器固着寄主。无叶，或退化成小的鳞片。花小，白色或淡红色，无梗或有短梗，成穗状、总状或簇生成头状的花序；苞片小或无；花 54 出数；萼片近于等大，基部或多或少连合；花冠管状、壶状、球形或钟状，在花冠管内面基部雄蕊之下具有边缘分裂或流苏状的鳞片；雄蕊着生于花冠喉部或花冠裂片相邻处，通常稍微伸出，具短的花丝及内向的花药；花粉粒椭圆形，无刺；子房 2 室，每室 2 胚珠，花柱 2，完全分离或多少连合，柱头球形或伸长。蒴果球形或卵形，有时稍肉质，周裂或不规则破裂。种子 14，无毛；胚在肉质的胚乳之中，线状，成圆盘形弯曲或螺旋状，无子叶或稀具细小的鳞片状的遗痕。本属植物约 170 种，广泛分布于全世界暖温带，主产美洲。菟丝子属植物易随寄主及其产品传播，其为可造成严重经济损失又难以防除的恶性杂草，因此世界上许多国家把其列为禁止或限制输入的有害生物。5总体原则本标准建立的方法不应完全取代形态学鉴定方法，而应与形态学鉴定方法 SN/T 1385 互为补充，相互佐证。6方法原理根据菟丝子属的 ITS 序列和 rbcL 基因特征，应用 DNA 条形码技术对菟丝子属植物进行筛查鉴定。7仪器用具和试剂7.1仪器及用具常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平（1/10 000 g） 、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 L、10 L、20 L、100 L、200 L、 1 000 L） 、离心管（2 mL） 、PCR 反应管（0.2 mL、0.5 mL） 。以正式出版文本为准3SN/T 4876.820207.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs） 、Taq 聚合酶、10PCR 缓冲液。CTAB 法提取试剂（参见附录 A 中 A.1） 。8筛查鉴定方法8.1样品的处理使用形态学方法无法完全判定的疑似菟丝子属植物及其近似属的植物材料，将需要提取 DNA 的植物材料（种子为 12 粒，硅胶干燥的茎为 10 mg） ，放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 r/s） 。8.2核酸的制备采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的CTAB 法方法参见附录 A 中 A.2。PCR 级 DNA 溶液的 OD260 /OD280比值应为 1.71.9。8.3DNA 条形码片段扩增利用 ITS 序列和 rbcL 基因的通用引物进行 ITS 序列和 rbcL 基因扩增，引物序列、反应程序和反应体系见附录 B。8.4PCR 产物的检测取 PCR 产物 5 L，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ITS 引物扩增可获得约 600 bp 的扩增片段，rbcL 引物扩增可获得约 700 bp 的扩增片段。8.5测序与序列处理取剩余的 PCR 扩增产物 45 L，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用 DNA 产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。9结果判定9.1中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统（http:/ ，点击“物种识别”导航条，进入物种识别页面。 在鉴定框内输入FASTA格式 （或纯文本格式） 序列后，点击 “提交鉴定” ，系统进行 BLAST 后，自动生成鉴定结果。如相似度最高的 10 条序列为菟丝子属序列，且最大相似度在 98% 以上，可明确判定为菟丝子属（参见附录 C） 。9.2植物有害生物检疫鉴定系统判定登录植物有害生物检疫鉴定系统（http:/ ，使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征且相似度为以正式出版文本为准4SN/T 4876.82020100% 的物种判定为该物种。 “植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法见附录 D。9.3国际通用数据库判定登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） ，在 BLAST 结果中查看序列相似性最高（Max ident or similarity）的物种，一般为与查询序列最接近的物种。菟丝子属常见近似种基因序列表信息参见附录 E。10凭证标本与原始数据保存10.1凭证标本保存采集到的标本应保存在干燥硅胶中。货物来源，菟丝子寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为 1 年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。10.2原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单（应包括 DNA 序列及测序峰图等内容）和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 以正式出版文本为准5SN/T 4876.82020附录A（资料性）DNA 提取方法（改良 CTAB 法）A.1试剂A.1.1CTAB提取液：CTAB 20 g/L，氯化钠1.4 mol/L，Tris 0.1 mol/L （pH 8.0） ，EDTA 0.02 mol/L （pH 8.0） ，高压灭菌备用。A.1.2三氯甲烷异戊醇：体积分数 241。A.1.350TAE 缓冲液：242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） ，充分溶解混匀后，加水定容至 1 L，高压灭菌备用。A.1.410 加样缓冲液：0.25溴酚蓝，40% 蔗糖。A.2提取步骤在含植物粉末的2 mL离心管中加入已预热至 65 的600 L CTAB提取液，充分振荡混匀；65 水浴 30 min，不时颠倒混匀；10 000 r/min 离心 5 min，取上清，等体积三氯甲烷 - 异戊醇（三氯甲烷 : 异戊醇 =24 : 1）抽提一次；取上清，再加入等体积异丙醇，4 沉淀 10 min 以上，然后 12 000 r/min 离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤1次2次，晾干后，加入20 L TE缓冲液溶解沉淀，保存于-20 冰箱冷冻备用。 以正式出版文本为准6SN/T 4876.82020附录B （规范性）序列扩增引物及流程B.1引物序列及反应程序引物序列及反应程序见表 B.1。表 B.1引物序列及反应程序引物引物序列反应程序ITS Forward ITS5GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G94 , 5 min；35（94 , 30 s；56 , 30 s；72 , 30 s） ；72 , 7 min Reverse ITS4TCC TCC GCT TAT TGA TAT GCrbcL Forward rbcL-1FATG TCA CCA CAA ACA GAA ACT94 , 5 min；35（94 , 30 s；50 , 30 s；72 , 30 s） ；72 , 7 min Reverse rbcl-724RCGG TAC CAG CGT GAA TAT GATB.2PCR 反应体系PCR 反应体系见表 B.2。表 B.2PCR 反应体系成分储备液浓度50 L 反应体系加样体积（L）dNTP 混合物（各 10 mmol/mL）2.5 mmol/L4.010PCR 缓冲液（含 Mg2+）5.0正向引物10 pmol/L2.0反向引物10 pmol/L2.0Taq 酶5 U/L0.5DNA 模板0.3 g/L 6 g/L2.0ddH2O补至 50 L同时要设置阳性对照，空白对照（以 ddH2O 代替 DNA 样品） ，每个样品重复 2 次。可用商品化的 PCR Premix。以正式出版文本为准7SN/T 4876.82020附录C（资料性）中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统操作方法见图 C.1 和图 C.2。图 C.1物种识别页面图 C.2鉴定结果页面以正式出版文本为准8SN/T 4876.82020附录D （规范性）植物有害生物检疫鉴定系统操作方法登录植物有害生物检疫鉴定系统（http:/ ，首页选择“基因条码”模块，在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对” ，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在 “更多比对结果”里，点击“开始对比” ，将符合该类群鉴定特征且相似度为 100% 的物种判定为该未知种。以南方菟丝子 Cuscuta australis 为例，在 “输入比对的序列” 窗口中粘贴 rbcL 基因片段，点击 “比对” ，相似性最高的条码序列对应分类阶元为菟丝子属 Cuscuta，相似性为 100%。在这一栏点击“开始对比” ，相似度为 100% 的序列对应物种为南方菟丝子 Cuscuta australis，即可判定查询序列为该物种。以正式出版文本为准9SN/T 4876.82020附录E（资料性）菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 GenBank 登录号菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 GenBank 登录号见表 E.1。表 E.1菟丝子属常见种 ITS 和 rbcL 序列 Gen Bank 登录号序号中文名学名ITSrbcL1五角菟丝子Cuscuta pentagonaKX430874KX430875KX430876KX430877KX430878KX430892KX430894KX430899KX430900KX4309012田野菟丝子Cuscuta campestrisKX430863KX430864KX430865KX430866 KX430867KX430886KX430887KX430888KX430889KX4308903南方菟丝子Cuscuta australisKX430858KX430859KX430860KX430861KX430862KX430879KX430880KX430881KX430882KX4308854菟丝子Cuscuta chinensisKX430868KX430869KX430870KX430871KX430872KX430873KX430883KX430884KX430891KX430893KX430895KX430896KX430897KX4308985杯花菟丝子Cuscuta applanataEF194603EF194604EF194605EU330272KJ436622KJ4366236小菟丝子Cuscuta liliputanaEU288362EU288363EU288364KJ436675KJ436676KJ4366777太平洋菟丝子Cuscuta pacificaGQ254887GQ254888GQ254889GQ254883GQ2548848檀香山菟丝子Cuscuta sandwichianaEU288356EU288357EU288358AY101057KJ4367129伞形菟丝子Cuscuta umbellataHM748903HM748904HM748905KJ436726KJ43672710威氏菟丝子Cuscuta veatchiiEU288353EU288354EU288355KJ436730KJ436731以正式出版文本为准10SN/T 4876.82020参 考 文 献1方瑞征 , 黄素华 . 中国植物志 : 第 64 卷 1 分册 M. 北京 : 科学出版社 . 1979:143-148.2HEBERT P D N, CYWINSKA A, BALL S L, et al. Biological identifications through DNA barcodesJ. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, 2003, 270 (1512): 313-321.3LAHAYE R, VAN DER BANK M, BOGARIN D, et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspotsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2008, 105(8): 2923-2928.4SCHINDEL D E, MILLER S E. DNA barcoding, a useful tool for taxonomistsJ. Nature, 2005, 435: 17.5TABERLET P, GIELLY L, PAUTOU G, BOUVET J. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNAJ. Plant Molecular Biology, 1991, 17(5): 1105-1109.以正式出版文本为准以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 26 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：155175110 定价 18.00 元DNA条形码方法 菟丝子属行 业 标 准SN/T 4876.82020*SN/T 4876.82020北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址