CIK细胞制备标准操作程序.doc

CIK细胞制备标准操作程序

1 目的和范围：
1.1 目的：规范CIK细胞培养过程，保证操作准确，避免人为操作误差导致实验效果不良或失败。
1.2 范围：该规程适用于实验室细胞培养技术人员CIK细胞培养操作的全过程。

2 原理：
2.1 外周血单核细胞经细胞刺激因子诱导后分分化为CIK细胞。

3 相关文件：
3.1

4 物料：
4.1 试剂：75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基,CIK条件培养基1、CIK条件培养基2 。
4.2 仪器设备：生物安全柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱，电动移液枪，10ul移液枪，200ul移液枪，医用剪刀，医用止血钳，试管架。
4.3 耗材： T175透气培养瓶（175cm2Flask），T75透气培养瓶（75cm2Flask），CO2透气培养袋，15ml离心管，50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管，50ml一次性注射器,5ml一次性注射器，200ul枪头。

5 记录
5.1 DC-CIK细胞制备记录。

6 职责：
6.1 细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行CIK细胞培养操作。
6.2 QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保CIK细胞培养操作的规范性。
6.3 审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。

7 工作程序：
7.1 实验前准备：
7.1.1 洁净区及工作台紫外照射≥30min，风机开启30分钟。
7.1.2 物料准备：将已灭菌且在有效期内器械放于物料传递窗进行紫外照射，≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入生物安全柜中备用。
7.1.3 单核细胞分离液（Ficoll）提前30min从4℃冰箱取出待用。
7.1.4 单核细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基，血清，在实验前需提前准备好放入生物安全柜中，以便其恢复常温，否则将会影响实验效果。
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7.1.2
7.2 分离
7.2.1 制备血浆：
7.2.1.1 将样本从医疗器械盒中小心地取出，用酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。
7.2.1.2 打开器械盒（注意手不得从打开的器械盒上方通过），用生物安全柜中的止血钳从器械盒中取出灭菌指示卡，确认已灭菌。取出器械盒中止血钳，用其夹紧血袋软管下方。
7.2.1.3 用浸泡过碘伏和酒精的棉签对软管中上部交替消毒两次，（先碘伏，后酒精，如此交替两次）用生物安全柜中的止血钳取出器械盒中的医用剪刀，用碘伏和酒精对其交替消毒两次，用医用剪刀将软管剪断。将全血转移至50ml离心管，每管25ml。
7.2.1.4 室温1800rpm，离心10分钟（离心机升降速以ST16为例:升9降4）。
7.2.1.5 取上层血浆至50ml离心管，灭活（56℃水浴30min）。
7.2.1.6 4℃放置30分钟。
7.2.1.7 2800rpm离心8min,，上清分于3支15ml离心管中，-20℃保存。
7.2.2 提取PBMC：
7.2.2.1 将生理盐水经酒精擦拭消毒后放入生物安全柜中，用碘伏和酒精对生理盐水瓶瓶口进行2次交替消毒后，用止血钳将瓶塞扒开并放置于工作台右上方位置。
7.2.2.2 按生理盐水：血细胞=1.5:1对血细胞进行稀释，混匀。
7.2.2.3 按照1.5：1的比例，加生理盐水至吸弃血浆后的样本，混匀，缓慢加在Ficoll 液面上（方法：将离心管倾斜45°，在Ficoll液面上1cm处，缓慢注入稀释的血细胞，不要打乱液面界面），加入后终体积不超过45ml， 2000 rpm，20min，室温(注意：调整离心机加速和减速过程为最低，调电动移液枪输出速度至最低）。
7.2.2.4 离心后，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层。
7.2.2.5 用巴氏滴管缓慢提取Ficoll层与血浆层交界处的白膜层细胞，按照二个离心管对应一个离心管进行漂洗的原则，将提取的白膜层细胞装入50ml离心管中。补充生理盐水至45ml，混匀，1600rpm， 5分钟。
7.2.2.6 弃上清，用生理盐水重悬，收集于一个50ml离心管中，补充生理盐水至45ml。1200 rpm，10min。
7.2.2.7 弃上清，再次添加生理盐水重悬至45mL，混匀，取0.5ml中层悬液至1.5mlEP管中计数，1000rpm，10min。
7.2.2.8 取上清至15ml离心管中，标记，送检微生物并留样，上清量应满足检测及留样要求，其余上清废弃。
7.2.3 接种：
7.2.3.1 用培养基调整细胞浓度为1~2´106/ml。
7.2.3.2 D0天完全培养基配制：每20ml培养基（10%自体血清）添加1支CIK条件培养基（规格：500ul/支）。
7.2.3.3 混匀，根据培养液体积添加到25cm2Flask或者75cm2Flask中。
7.2.3.4 水平放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。
7.2.3.5 填写相关记录,清场。
7.3 加液
7.3.1 时间及方式：当培养基颜色变黄或细胞浓度接近饱和时，以倍增方式补液。
7.3.1.1 一般加液时间为：D2，D4，D6，D8，D10，D12（加液时间视细胞具体生长情况可提前或延后）。
7.3.1.2 D2-D14天，完全培养基的配制：每瓶培养基（1000ml）添加1支CIK条件培养基2（规格：1ml/支）
7.3.2 添加方法：轻轻摇匀，避免起气泡；拧好瓶盖，水平放入37℃、5%CO2培养箱继续培养。
7.4 转瓶：当75cm²Flask细胞悬液总体积达到60ml，且需要继续补液时。
7.4.1 将75cm²Flask中细胞悬液全部倒入新的1752Flask培养瓶中。
7.4.2 向75cm²Flask中添加适量培养基对瓶内细胞进行涮洗并倒入1752Flask培养瓶中，再添加适量新鲜培养基（加5%自体血清）。
7.4.3 拧紧175cm²Flask瓶盖，水平放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。
7.5 转袋或分瓶：当175cm²Flask中细胞悬液总体积达到250ml，且需要继续补液时。
转袋：
7.5.1 取50ml注射器，弃去针头及助推器。放入注射器支架的圆孔内。
7.5.2 用碘伏和酒精对培养袋导管盖子下1-2㎝处交替消毒两次。
7.5.3 用止血钳取下前端盖子，连接管口与注射器。
7.5.4 将175 cm²Flask中的细胞悬液缓慢倒入注射器内。
7.5.5 用适量培养基涮洗175 cm²Flask，按7.3.1.3和7.3.2.2的方法继续向细胞培养袋中添加培养基，至加液总体积达到应添加量。
7.5.6 培养基添加完毕，用止血钳夹紧导管前端，将细管与注射器分离并将细管抬高，确保培养基全部进入细胞袋中。用止血钳将细管盖子盖上并拧紧，用塑料夹将导管末端夹紧。
7.5.7 将培养袋平放，用双手轻轻按摩袋子十余下，使细胞与培养基混匀。用碘伏和酒精对培养袋取样口进行交替消毒，用一次性注射器取样0.5ml，标记，送检微生物检测。
7.5.8 培养袋标记后双手托住培养袋下方自生物安全柜中取出，用托盘将其送至培养室，水平放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。
7.5.9 分瓶：按培养瓶中培养基体积等分，按倍增的方式分瓶培养，加液按步骤7.3.1.3和7.3.2.2要求添加新鲜培养基。分瓶完毕，拧好盖子，每个培养瓶均做好标记后放入37℃，5%的二氧化碳培养箱。（此步骤仅适用于分瓶培养）
7.5.10 填写相关记录。
7.5.11 培养袋转移方法：放置在托盘上。
7.6 分袋：计划需求且培养袋中细胞悬液总体积达到1000ml时。
7.6.1 混匀后对应将样本挂于生物安全柜中的挂钩上。
7.6.2 取50ml注射器，弃去针头及助推器。放入注射器支架的圆孔内。
7.6.3 取新的细胞培养袋，用碘伏和酒精对其盖子下1-2㎝处交替消毒两次。用止血钳取下盖子，连接管口与注射器。
7.6.4 用止血钳夹紧原培养袋导管，碘伏和酒精对其盖子以下1-2㎝处交替消毒两次，取下盖子。（注意开盖时，细管的前端应高于培养袋中细胞培养液的液面，并且培养袋塑料夹处取夹紧状态，防止在拧开盖子时，液体突然涌出）
7.6.5 再次混匀后，松开止血钳，通过注射器将原培养袋中的细胞悬液加入到新的培养袋。加液时（按7.3.1.3和7.3.2.2步骤），当液面增至注射器套筒50ml刻度线后，停止加液并松开新增培养袋导管止血钳，使液面降至0刻度线，再次用止血钳夹紧新增培养袋细管并加液，按上述方法每50ml一次，重复数次进行加液，至原培养袋中一半培养基转入新增培养袋。用止血钳夹紧细管前端，将其置于生物安全柜左上角。
7.6.6 填写相关记录，清场。

7.7 细胞收获：
7.7.1 检查培养袋标记是否与回输计划相符。
7.7.2 取出，酒精擦拭消毒后，放入生物安全柜，挂于生物安全柜内的挂钩上。
7.7.3 取若干50ml离心管，标记，拧开离心管盖，整齐的置于工作台上方，调整离心管刻度朝向操作者。
7.7.4 混匀培养袋中细胞悬液。用止血钳夹紧培养袋导管，碘伏与酒精对导管盖子下方1-2cm处进行交替消毒，拧开培养袋的盖子并放于工作台左前方。
7.7.5 一手握止血钳，一手拿导管，慢慢松开止血钳，由慢到快将细胞悬液引入离心管中。
7.7.6 操作中导管口应处于离心管口正上方，待离心管装满细胞悬液后，夹紧导管，转移至另一离心管中继续添加细胞悬液，直至达到收集体积。
7.7.7 将导管口抬起，使部分培养基回流，若还需添加新鲜培养基，则用止血钳将导管前端夹紧，放置于工作台左上方，待离心管移出生物安全柜后，可立即进行加液处理。若不进行加液则拧上导管盖子，并用塑料夹将导管末端夹紧，移出安全柜，放入培养箱继续培养。
7.7.8 细胞清洗：
7.7.8.1 配平，1300rpm，8分钟。
7.7.8.2 用碘伏和酒精对生理盐水瓶口进行交替消毒2次，用止血钳拔开橡胶塞，将生理盐水置于工作台右上方备用。
7.7.8.3 待离心完毕，弃上清，收集细胞于两个离心管中，1300rpm离心8分钟。
7.7.8.4 废上清，收集细胞于一个离心管管中，添加生理盐水至45ml，混匀，取0.5ml中间层悬液计数及活率检测。
7.7.8.5 1300rpm，8分钟，取上清至15ml离心管中作革兰氏、内毒素检测并留样，多余的废弃。
7.7.8.6 用生理盐水重悬细胞，如无自体血清用5ml 人血白蛋白和15ml生理盐水重悬细胞，混匀。
7.7.9 装袋或装瓶，100ml/瓶或袋：
7.7.9.1 取出转移袋，消毒后移入安全柜，用止血钳夹住转移袋导管，用碘伏和酒精对止血钳上方导管进行交替消毒两次。
7.7.9.2 用止血钳将已高压灭菌的剪刀从器械盒中取出，经碘伏和酒精交替消毒后，将转移袋细管从已消毒部分倾斜剪断。
7.7.9.3 取50ml注射器，拔掉推塞后与转移袋细管通过针头连接口连接。
7.7.9.4 将细胞悬液通过注射器套筒导入转移袋，再用适量生理盐水对离心管进行涮洗并导入转移袋保证终体积为100ml/袋，反复混匀（留样1ml细胞稀释液，标注个人信息，无菌密封好-20℃冰箱永久保存。
7.7.9.5 将转移袋中空气全部排出后，用止血钳夹紧导管并移出生物安全柜。
7.7.9.6 热合，剪掉多余部分，在回输袋上粘贴相应的回输信息标签（核对姓名，ID号，性别等），用外包装袋密封后，传出洁净区。
7.7.9.7 填写相关记录。
7.8 微生物检测控制点与回输质量控制：
7.8.1 细胞接种前取单核细胞最后一次清洗上清2ml液做微生物检测(细菌培养和真菌培养)
7.8.2 细胞回输前3-4天取样在培养的细胞悬液2ml做微生物检测(细菌培养和真菌培养)
7.8.3 每次回输当日，取细胞上清做内毒素检测，革兰氏染色；待所有质检报告结果已出，质检人员出具细胞合格的质检报告单后，细胞制品方可实验室出库送往治疗室行细胞回输。
7.9 注意事项
7.9.1 培养袋培养总体积不超过1800ml

8 参考文献：
8.1 无。
9 变更：
修订号
修订原因与内容
执行日期
00
新建
2016.3.1