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流式细胞术检测外周血单核细胞HLA-DR表达与脓毒症的关系
王兆丰 黄俊军 陈松劲
（浙江省嘉兴市第二医院 314000）
[摘要]目的 通过测定单核细胞活化功能来监测脓毒症患者的免疫功能并评价其临床意义。方法 健康体检人群对照组和ICU病房患者（分为A组、B组、C组）用流式细胞术测定外周血HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+MFI。结果 ICU病房患者与健康体检人群比较外周血HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+ MFI显著降低（p <0.001）， B组、C组与A组比较HLA-DR+/CD14+降低（p <0. 01）。C组与B组比较HLA-DR+/CD14+降低（p <0. 01）。结论 患者HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+MFI表达持续低下可提示患者处于免疫麻痹状态，在脓毒症患者中检测细胞因子HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+MFI表达来监测其免疫功能是一种早期的、可预见的评估脓毒症严重程度和预后的方法。
[关键词] 脓毒症 HLA-DR+/CD14+ 免疫麻痹 流式细胞术
Relation of monocyte HLA-DR in whole blood by flow cytometry with sepsis
wang zhao-feng. huang Jun-jun. Chen Song-jin
The second hospital of JiaXing，Zhejiang 314000
[Abstract]Objective To monitor of monocyte human leukocyte antigen DR to evaluate the clinical significance in sepsis. Methods measured HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+ MFI by flow cytometry with the ICU patients and the healthy Results the expression of HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+ MFI in the ICU patients were lower than that in the healthy（p <0.001）; the expression of HLA-DR+/CD14+ in the grow B and C were lower than that in the grow A（p <0.01）; the expression of HLA-DR+/CD14+ in the grow C were lower than that in the grow B（p <0.01）;Conclusions low level of HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+ MFI show the patients were in the states of immune paralysis, monitor expression of cytokines HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+ MFI can be used to evaluate the severity of disease and predict prognosis in sepsis that is a early、foreseeable methods .
[key word] Sepsis HLA-DR+/CD14+ Immune paralysis Flow cytometry
细胞因子正成为预测免疫功能的标志，脓毒症（sepsis）是指由感染引发的全身炎症反应综合症。可能并不像以往的“过度炎症反应”，更多的是由于“过度抑制”参与其中，有学者认为在初期炎症反应之后发生的抗炎反应的本质是单核细胞失活所致的免疫功能不全。称之为免疫麻痹。[1]
1.资料与方法：
1.1研究对象及处理：健康体检人群对照组（n=20）。ICU病房患者（包括创伤 烧伤、大手术和胰腺炎等）67例患者。其中男39例，女28例，将其分为A组（非脓毒症）B组（符合脓毒症但未达到严重脓毒症诊断标准）C组（符合严重脓毒症诊断标准）。诊断标准：脓毒症、严重脓毒症、MODS的诊断标准参考美国胸科医师协会（ACCP）和美国危重病医学会联席会议制定的诊断标准。[2]
1.2试剂仪器：流式细胞仪采用美国COULTER-EPICS-XL型四式荧光流式细胞仪。试剂：法国Immunotech公司生产，CD14-FITC，HLA-DR-PE，同型对照：IgG1-FITC、IgG1-PE
1.3标本采集：所有待测标本均为当天新鲜采集，含EDTA-K2的真空采血管采集静脉血抗凝全血。
1.4检测方法：对照管加入10ul IgG1-FITCI、IgG1-PE10ul，测定管加入10ul CD14-FITC和10ul HLA-DR-PE，分别加入100 ul的EDTA抗凝新鲜全血，室温避光孵育20分钟，用CoulterQ-PREP溶血仪溶血后上机单核细胞HLA-Dr表达百分率（HLA-Dr+/CD14+）及其平均荧光强度(HLA-Dr+/CD14+MFI)。
1.5统计学方法：计量资料数据均数±标准差表示，两样本均数间比较采用独立样本t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1健康人群对照组与研究组年龄、性别、吸烟史无差异，研究组WBC、CRP、IL6较健康人群对照组均有明显升高（p <0.01），但C组与B组比较无差异（P>0.05）。各组基本资料数据见表1。
表1 基本资料数据

健康体检人群（n=20） A组（n=22） B组（n=19） C组（n=26）

年龄（岁） 61.3±10.3 56.2±15.8 62.3±13.4 59.6±15.4
性别（男） 12(60%) 14 (64%) 13(68%) 17(65%)
吸烟 9(45%) 9 (41%) 9(47%) 12(46%)
WBC（109/ml） 5.80±1.83 9.45±4.86 * 13.62±5.24* 14.49±5.10*#
CRP（mg/ml） 4.2±1.9 28.6±15.6* 98.5±41.2* 107.9±49.2*#
IL6（ug/L） 0.13±0.03 0.19±0.06* 0.23±0.05* 0.27±0.12*#

与健康体检人群比较 *p <0.01
C组与B组比较 #P>0.05
2.2 ICU病房患者与健康体检人群比较外周血HLA-Dr+/CD14+、 HLA-Dr+/CD14+MFI显著降低（p <0.01），见表2。
表2 正常体检人群与ICU病房患者比较

健康体检人群（n=20） ICU病房患者（n=67）

HLA-Dr+/CD14+ 90.95±6.10 45.56±28.77*
HLA-Dr+/CD14+MFI 6.88±1.71 4.12±1.66*

与健康体检人群比较*p <0.01
2.3 B组、C组较A组外周血HLA-Dr+/CD14+显著降低（p <0. 01），HLA-Dr+/CD14+MFI也有降低（P<0.05）；C组较B组外周血HLA-Dr+/CD14+ 阳性率显著降低（p <0. 01），HLA-Dr+/CD14+MFI比较无统计学意义（P>0.05），见表3。
A组与B组C组比较

HLA-Dr+/CD14+ HLA-Dr+/CD14+MFI

A组（n=22） 70.23±11.41 5.49±2.56
B组（n=19） 44.88±11.74* 3.86±0.81**
C组（n=26） 20.93±8.63*# 3.41±0.81**##

B组、C组与A组比较*p<0.01；**P<0.05
C组与B组比较# p<0.01；## P>0.05
3.讨论
ICU病房患者多为创伤、烧伤、大手术等，其死亡的主要原因是细菌感染和MODS，它可能与免疫系统受损引起的细菌易感性增加有关,内毒素可直接通过血浆LPS结合蛋白介导而结合于多种细胞的CD14受体和TOLL样受体（共受体），启动信号传导刺激髓系（单核/巨噬细胞）和非酶系（内皮、实质细胞）产生和释放一系列促炎因子（IL-1、IL-6）和炎症介质（NO、PGS等）这是导致创伤、感染、免疫麻痹的重要原因和分子基础 [3] 。CRP是人体抵抗各种外界损伤时参与急性期反应时限的一种糖蛋白， 被广泛应用于作为评价创伤和炎症反应程度的一个敏感指标。我们选择健康人群对照组与研究组年龄、性别、吸烟史无差异，发现研究组IL6和WBC、CRP水平较健康人群对照组均有明显升高（p <0.01）,表明ICU病房患者在疾病发生发展过程中细胞因子有过多释放，机体存在着过度的炎症反应；但C组和B组IL6和WBC、CRP水平比较并无差异，提示 ICU病房患者多表达为高的前炎因子和抗炎因子,但其对患者的疾病严重程度预见性、相关性不足。而研究组HLA-DR+/CD14+、HLA-DR+/CD14+MFI 较健康人群对照组有明显下降（p <0.01），且C组与B组比较显著降低（p <0.01），提示HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI是比IL6和WBC、CRP更早期的、敏感的、可预见的指标。
单核细胞在抗细菌感染的免疫应答中起关键作用，他不仅可以释放趋化因子、细胞因子、还可表达MHC-II类抗原，单核细胞诱导抗原特异性淋巴细胞活化的能力下降将削弱集体清除外来抗原的能力。HLA-DR抗原在人类单核细胞是最常见的表达区域 [4] 。 HLA-DR与单核巨噬细胞处理抗原后向淋巴细胞提呈抗原的能力有直接关系。能够作为定量的诊断免疫抑制的检查目前可能首推CD14+单核细胞的HLA-DR[5] 。本研究表明ICU病房患者与正常体检人群比较外周血HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI显著降低（p <0.01）。其中52名病人（占78％）入住ICU时的外周血单核细胞HLA-DR表达率低于70%，表明ICU病人多有不同程度的免疫麻痹或免疫紊乱。提示ICU病房患者有必要常规检测外周血HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI作为监测免疫抑制的定量指标。2１名病人（占31％）入住ICU时的外周血HLA-Dr+/CD14+低于30%，其死亡率达到71％。提示HLA-Dr+/CD14+严重低下患者处于免疫麻痹状态，病情重、预后差。我们认为采用流式细胞术检测细胞因子HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI，具有先进、准确、简便、快速等优点。HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI能够定量的诊断免疫抑制，HLA-Dr+/CD14+低于70%提示患者存在一定免疫麻痹，HLA-Dr+/CD14+低于30%作为严重脓毒症的诊断参考指标。
综上所述机体处于免疫麻痹状态时HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI表达降低。提示ICU病房患者有必要常规检测外周血HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI作为监测免疫抑制的定量指标，患者多表达为高的前炎因子和抗炎因子,但其对疾病严重程度的预见性、相关性不足，应用流式细胞术在脓毒症患者中检测HLA-Dr+/CD14+、HLA-Dr+/CD14+MFI来监测其免疫功能是一种定量的、早期的、可预见的方法。
参考文献
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[3]MolleR DE.Potential Role of TNF-alpha in the pathogensis of insulin Resistance and type 2 disbetes[J].T RENDS EndocRinol Metab,2000,11:212
[4]Johnston RB J:CuRRent concepts:immunology:monocytes and macRophages[J].N Engl J Med,1988,318(6):747-752
[5]林洪远等。CD14+单核细胞人类白细胞抗原DR预测浓度症预后几指导棉衣调理治疗的初步临床研究[J]。中国危重病急救医学，2003，15（3）：135-138