EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡.pdf

.4326ECCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红，等EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红，麦燕，钱沁佳三亚中心医院妇产科，海南三亚57 2 0 0 0【摘要】目的：探究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EG Cg）特异性抑制芳香乙酰胺脱乙酰基酶蛋白（arylacetamidedeacetylase，A A D A C）来诱导卵巢癌细胞发生铁死亡的分子机制。方法：体外培养卵巢癌细胞系（SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y 和SW626）。CCK-8 检测ECCg对卵巢癌细胞的半数抑制浓度（median inhibition concentration,ICso）。铁离子检测试剂盒检测细胞内Fe2+的含量。活性氧（reactive ox-ygen species,ROS）检测试剂盒检测细胞内ROS 的含量。Westerm blot 检测细胞内铁死亡相关蛋白GPX4和NOX1的表达。酶活实验检测ECCg对AADAC活性的影响。Westernblot检测EGCg对AADAC蛋白的影响。应用免疫组化和Westernblot检测卵巢癌患者组织中AADAC的表达。应用siRNA沉默卵巢癌细胞总AADAC的表达。应用AADAC-KO敲除卵巢癌细胞中AADAC的表达。皮下成瘤验证小鼠体内EGCg对卵巢癌移植瘤生长的影响。结果：ECCg能抑制卵巢癌细胞的增殖,且对SK-OV-3和SW626细胞较为敏感。ECCg使卵巢癌细胞中Fe2+含量增加,ROS含量增加，并抑制GPX4蛋白表达，促进NOX1蛋白的表达。ECCg能抑制AADAC蛋白的活性并促进其降解。AADAC在卵巢癌患者癌组织中高表达。沉默AADAC能促进卵巢癌细胞发生铁死亡。沉默AADAC后ECCg对卵巢癌细胞变得不敏感,并不能促进铁死亡的发生。相对于NC组,ECCg能抑制裸鼠移植瘤的生长，且移植瘤中AADAC表达下降，铁死亡被激活。结论：ECCg能特异性抑制AADAC来诱导卵巢癌细胞发生铁死亡。【关键词】EGCg；A A D A C；卵巢癌；铁死亡；GPX4【中图分类号】R737.31【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.23.006【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 3)2 3-432 6-0 8EGCg can induce ferroptosis in ovarian cancer cells byspecifically inhibiting AADACAI Yuehong,MAI Yan,QIAN QinjiaDepartment of Obstetrics and Gynecology,Sanya Central Hospital,Hainan Sanya 572000,China.【A b s t r a c t】1 Objective:To explore the molecular mechanism of epigallocatechin gallate(EGCg)specifically inhibi-ting arylacetamide deacetylase(AADAC)to induce ferroptosis in ovarian cancer cells.Methods:Ovarian cancer celllines(SK-0V-3,A2780,Hey and SW626)were cultured in vitro.CCK-8 was used to detect median inhibitionconcentration(ICso)of EGCg in ovarian cancer cells.The iron ion detection kit detected the content of Fe2+ions incells.The reactive oxygen species(ROS)detection kits measured the amount of ROS in cells.The expressions of fer-roptosis related proteins GPX4 and NOXI were detected by Western blot.The effect of ECCg on AADAC activity wasdetected by enzyme activity test.The effect of EGCg on AADAC protein was detected by Western blot.Immunohisto-chemistry and Western blot were used to detect AADAC expression in ovarian cancer patients.siRNA was used to si-lence the expression of total AADAC in ovarian cancer cells.AADAC expression in ovarian cancer cells was knockeddown by AADAC-KO.The effect of EGCg on the growth of ovarian cancer transplantation tumor was verified by sub-cutaneous tumorigenesis.Results:EGCg could inhibit the proliferation of ovarian cancer cells and is sensitive to SK-OV-3 and SW626 cells.ECCg increased the content of Fe*and ROS in ovarian cancer cells,inhibited the expres-sion of GPX4 protein and promoted the expression of NOX1 protein.EGCg could inhibit the activity and degradation ofAADAC protein.AADAC was highly expressed in ovarian cancer patients.Silencing AADAC promoted ferroptosis inovarian cancer cells.ECCg became insensitive to ovarian cancer cells after knockout of AADAC and did not promoteferroptosis.Compared with NC group,EGCg inhibited the growth of transplanted tumor in nude mice,and AADAC ex-pression was decreased and ferroptosis was activated in transplanted tumor.Conclusion:EGCg could specifically in-hibit AADAC to induce ferroptosis in ovarian cancer cells.【收稿日期】2023-03-09【修回日期】2023-07-17【基金项目】海南省卫生计生行业科研计划项目（编号：18 A200164）【作者简介】蔡月红（198 5一），女，湖北潜江人，主治医师，主要从事妇科肿瘤的临床治疗工作。Ema i l：c a i y u e h o n g 198 5 16 3.c o m?4327MODERNONCO.31.No.23现代肿瘤医学2023年12 月第31卷第2 3期Key words ECCg,AADAC,ovarian cancer,ferroptosis,GPX4在美国，2 0 2 3年卵巢癌居女性恶性肿瘤死亡率第五位。在女性生殖系统肿瘤中,卵巢癌的发病率排第三位。相较于宫颈癌和子宫内膜癌，卵巢癌由于早期症状不明显且不易排查，患者常发展到晚期才被诊断出来，且晚期卵巢癌患者的5年生存率只有2 0%30%2 。目前，手术治疗仍是卵巢癌的治疗核心，但仅针对早期卵巢癌患者有较好疗效。针对晚期和复发的卵巢癌患者的治疗，仍是一项艰巨的挑战3。因此,针对卵巢癌新的治疗靶点和药物的研究显得极其重要。天然多酚是一种常见的食品成分，可从绿茶等植物中提取。在过去几十年的科学研究中,绿茶和它特有的多酚，已经被证明在预防肥胖、糖尿病、心血管疾病、癌症和其他疾病中起到重大作用4。绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯（e p i g a l l o c a t e c h i n g a l l a t e,EG Cg）是一种天然的抗肿瘤药物。ECCg的抗癌活性已在不同动物模型和细胞系中得到证实4。现研究表明,ECCg是一种氧化还原活性分子,其可以通过自身的自氧化产生活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）和过氧化氢，进而引起细胞发生氧化应激5。在抗肿瘤研究中,较高水平的ROS可引起肿瘤细胞的损伤，最终导致细胞死亡。尽管现在关于EGCg的研究很多，但EGCg发挥功能的靶点还是未知的。YASUDA教授6 于2 0 2 1年发现,EGCg能够有效抑制芳香乙酰胺脱乙酰基酶蛋白（arylacetamidedeacetylase，A A D A C)的酶活性。这提示我们,AADAC可能是EGCg发挥抗肿瘤作用的关键靶点。AADAC是一种芳基乙酰胺去乙酰化酶,主要在肝脏中表达,与药物代谢有关7 有研究表明,AADAC基因突变的患者有较低的药物清除率8 。在2 型糖尿病的研究中发现,将血管平滑肌细胞中的AADAC敲除后,细胞中脂质含量明显增加。在结肠癌的肝转移研究中，AADAC通过SLC7A11依赖性抑制脂质过氧化保护结直肠癌肝脏定植免于铁死亡9目前学术界普遍认为卵巢癌起源于卵巢伞部的干细胞10-1。在卵巢癌原始细胞遗传模型中发现,卵巢恶性肿瘤中转铁蛋白受体1（transferrinreceptor1,TFR1）的表达呈明显上调，而铁转运蛋白（ferroportin，FPN）的含量则明显降低，表明卵巢肿瘤早期阶段出现细胞内铁含量的升高。综上,EGCg能增加细胞内ROS的产生，引起细胞脂质过氧化。而AADAC作为一种脂质代谢相关基因,能抑制脂质过氧化从而抑制癌细胞发生铁死亡。因此，我们大胆推测EGCg可能通过抑制AADAC来促进卵巢癌细胞发生脂质过氧化，从而促进肿瘤细胞的铁死亡1资料与方法1.1标本收集收集2 0 2 0 年0 1月至2 0 2 1年0 6 月在我院手术治疗的78例卵巢癌患者的石蜡标本，患者平均年龄为（45.2 17.7)岁。同时，我们收集了3例卵巢癌患者的临床活体标本，每例分成若干份，冻存在8 0 冰箱中。本研究经医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意书。1.2实验方法1.2.1细胞培养卵巢癌细胞株SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y 和SW626均购Modern Oncology 2023,31(23):4326-4333自于ATCC（美国模式菌种收集中心）。所有细胞均用含10%胎牛血清（BI,Israel）、10 g/mL链霉素和10 0 U/mL青霉素（BI,Israel）的DMEM（G i b c o，M D，U SA）培养基，置于37、5%CO 2 的培养箱中培养。1.2.2细胞转染细胞于对数生长期时,用0.2 5%的胰蛋白酶消化细胞，将细胞按照每孔310 5个接种在6 孔板中。常规培养18 h后（细胞密度约为7 0%），按照Lipofectamine2000（In v i t r o g e n，USA)说明书进行转染,转染分组为：si-NC（转染 si-NC的阴性对照序列）、si一AADAC（转染siA A D A C的敲低序列）。siRNA的合成由上海GenePharma公司完成。所用siRNA序列见表1。细胞转染2 4h后,收获细胞提取蛋白或者消化细胞铺板进行下一步实验。表1siRNA序列Tab.1siRNA sequenceGene namePrimer sequencesi-AADAC#15-AAUAUAAUAUGCUAUGAGGAU-3*si-AADAC#25-AAUUUUGUAUAGUUUUCAGAU-3*1.2.3慢病毒感染通过 https:/zlab.bio/guide-design-resources/网站设计出2 条AADAC基因的敲除序列，分别为：KO1（T G A A T T GGGAAATGATACTT)和KO2(GGGCAGGATAAATTAAAGAC)。然后由上海GenePharma公司将序列构建到lentivirus crisprcas9V2质粒上并包装成慢病毒，慢病毒滴度为10 TU/mL。将慢病毒感染SK-OV-3和SW626细胞，通过嘌呤霉素（上海生工生物）筛选，铺单克隆，扩增，得到AADAC基因敲除的单克隆细胞株。后续将用该细胞进行一系列细胞和分子实验。1.2.4药物实验将EGCg(Sellcek,USA)配置成10 mmol/L的母液浓度，通过浓度梯度：40、2 0、10、5、2、1umoVL,筛选出SK-0V-3和SW626细胞的半数抑制浓度（median inhibition concentration，ICso）。得到对应细胞的ICso后,进行一系列的细胞和分子实验。1.2.5AADAC原核表达和纯化将AADAC的全长序列构建到pet28a质粒（His标签）上，经过BL21细菌的扩增和表达，Ni柱的回收和纯化后，得到AADAC蛋白。上述实验，均由北京义翘神州公司完成。1.2.6酶活实验根据YASUDA教授论文中描述的方法6 ，我们研究了EGCg对原核表达的AADAC蛋白酶活性的影响。具体方法如下：非那西汀作为AADAC的特异性底物。测定的底物浓度分别根据非那西汀在AADAC蛋白中的水解酶活性的Km值进行测定。为测定非那西汀水解酶活性，将含有100mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）、0.4m g/m LA A D A C和1mmol/L非那西汀的反应混合物在37 下孵育2 0 min。加人3%的高氯酸后，反应停止。然后通过高效液相色谱检测非那西汀的产物对氨基苯乙醚的含量，以此推算出AADAC的酶活性。：43 2 8.ECCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红，等1.2.7逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）使用Trizol试剂（15596 0 2 6,Invitrogen，U SA）提取总的RNA,按照 PrimeScript RT reagent Kit(RR047A,Takara,Japan)说明书，取5gRNA反转录cDNA，对合成的10 ngcDNA用Fast SYBR Green PCR试剂盒(Applied biosystems)进行RT-qPCR检测，每个孔均设置3个重复。-actin作为内参，采用2-AACT法分析AADAC、NO X1基因相对表达量，CT=（实验组目的基因平均CT值-实验组管家基因平均CT值）-（对照组目的基因平均CT值对照组管家基因平均CT值）。引物设计如表2 所示。表2引物序列Tab.2Primer sequenceGene namePrimer sequenceAADACF5-ATCGCTGTACCTTCTGATTGTG-3*R5-CAAAGCTCCCGACAACCTTAAA-3*NOX1F5-TTGTTTGGTTAGGGCTGAATGT-3*R5-GCCAATGTTGACCCAAGGATTTT-3*CPX4F5-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTA-3R5-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3-actinF5-CTTAATGTCACGCACGATTTC-3*R5-ACGTTATGGTGATGATATCG-31.2.8蛋白质印迹（Westernblot）胰蛋白酶消化法收集培养的各组细胞，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（武汉博士德公司）进行裂解，然后用BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德公司）进行蛋白浓度的测定。蛋白用10%SDS-PAGE进行分离，将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h以阻断非特异性结合，分别加人稀释的一抗（AADAC：a b 2 2 412 7;NO X1：ab131088;GPX4:ab125066;GAPDH:ab8245;Abcam,Cam-bridge，U K），4孵育过夜，洗膜加人HRP标记的羊抗兔二抗（ab205719；A b c a m，Ca mb r i d g e，U K）室温孵育1h，洗膜后加人ECL工作液（美国EMDMillipore公司），在化学发光仪中进行曝光。用ImageJ分析软件对Westernblot图像中各组条带进行灰度定量，GAPDH作为内参。每次实验重复3次。1.2.9细胞增殖实验将110 个/mL细胞接种到96 孔板中，每孔10 0 L常规培养过夜。按照CCK-8试剂盒（上海Beyotime）说明书处理细胞，分别在接种后的第2 4、48、7 2、96 h,以CCK-8法检测其细胞活力。每次检测时均加入10 L的CCK-8检测液，放入培养箱中孵育4h，用酶标仪（ThermoScientificMulti-skanFC）检测其在450 nm处的吸光度，绘制生长曲线。每次实验重复3次。1.2.10细胞内铁离子检测细胞中铁离子检测试剂采用北京范德生物的FerroOrangeFe2+检测探针。按照说明书，具体操作如下：在96 孔黑板（透明底）上接种10 0 L细胞悬液，使其达到10 个/well、在37、5%CO,培养箱中过夜培养；C组细胞用MEM（不含FBS)100L洗涤3次，添加10 0 L硫酸铵铁（II)/MEM（不含FBS）（最终浓度：10 0 mol/L），在37、5%CO，培养箱中静置30 min；用10 0 LHBSS洗涤所有孔的细胞3次，向A和C组细胞中添加10 0 L的1mol/LFerroOrangeworkingsolution，向B组细胞中添加10 0 L含有FerroOrange（最终浓度：1mol/L）和Bpy（最终浓度：10 0 mol/L)的HBSS溶液，在37、5%CO 2 培养箱中培养30 min；用多功能读板器检测各样品的荧光强度（Ex：543n m，Em：58 0 n m）。样品A：无添加剂（仅细胞）；样品B：添加了铁螯合试剂2,2-bipyridyl(Bpy）的细胞；样品C:添加铁（硫酸铵铁）的细胞。1.2.11细胞内ROS活性检测细胞中ROS检测采用的是碧云天公司的ROS检测试剂盒（S0033S）。按照说明书，具体操作如下：原位装载探针：按照1:10 0 0 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 mol/L。去除细胞培养液,加人适当体积稀释好的DCFH-DA,37细胞培养箱内孵育2 0 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进人细胞内的DCFHD A（在阳性对照孔中需要加入Rosup）。在酶标仪中检测各个孔的荧光亮度（使用48 8 nm激发波长，52 5nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱）。1.2.12蛋白降解实验选择SK-OV-3细胞进行实验。用10 g/mL放线菌酮（cycloheximide，CH X）和4mol/L的EGCg处理SK-OV-3细胞，分别在0、6、12 和2 4h时收获细胞，检测细胞中AADAC的表达。用1mol/L的蛋白酶体抑制剂MG132和4mol/L的ECCg处理SK-OV-3细胞,2 4h后收获细胞，检测细胞中AADAC的表达。1.2.13免疫组化取组织标本用石蜡包埋，切片，然后进行脱蜡至水，酒精梯度脱水，自来水洗2 min;3%的H,02中2 0 min;蒸馏水洗2min,0.1mol/LPBS洗3min;抗原修复液中水浴修复，自来水冷却；组织片上滴加正常山羊血清封闭液（C-0005，上海浩然生物科技有限公司），室温放置2 0 min，甩干玻片上的液体；在组织片上滴加1:2 0 0 的AADAC（a b 2 2 412 7，A b a c m，UK)抗体，4过夜，在0.1mol/LPBS中洗3次，5min/次；组织片上滴加山羊抗兔IgG（a b 150 0 7 7,1:10 0 0,A b c a m，U K）二抗，37 放置2 0 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素蛋白工作液（0 34310 0 0 0 U,北京易默生物技术有限公司）,37 放置2 0 min，D A B（ST 0 33，广州威佳科技有限公司）显色，显色结束后水洗；苏木素（PT001,购自上海博谷生物科技有限公司）复染1min，水洗；1%氨水返蓝，一定浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明；中性树脂封片；显微镜下观察并摄片：每张切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野数10 0个细胞。1.2.14裸鼠移植瘤实验10只健康裸鼠（中国医学科学院北京药理学研究所提供），6 8 周龄，将裸鼠饲养于SPF级动物实验室，实验室湿度6 0%6 5%，温度2 2 2 5，并且在12 h光照和黑暗循环下提供食物和水，适应性饲喂一周后开始实验，实验前观察裸鼠健康状态。本实验程序及动物使用方案已得到动物伦理委员会的批准。实验分组：NC组和EGCg组，每组5只。在饲养过程中，取10 0 LSK-0V-3细胞（510 个/mL)皮下注射至裸鼠腋下，对裸鼠进行成瘤实验。待移植瘤生长体积至10 0 mm后，腹腔注射10 mg/kg的ECCg，每2 天注射.4329MODERNONCO.31.No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期一次。继续饲养4周，对裸鼠实施安乐死，测量肿瘤大小，剥离肿瘤，称重并收集瘤体进行后续检测。裸鼠移植瘤体积的测量方法：V=ab/2(a为长径，b为短径）。1.3统计学方法本研究资料统计分析均采用SPSS21.0(IBM,USA)统计软件进行分析。计量资料以平均值土标准差表示，癌组织与癌旁组织间的比较采用配对t检验，组间采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1EGCg能促进卵巢癌细胞发生铁死亡我们选择了4株卵巢癌细胞（SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y和SW626）,并用浓度梯度的EGCg处理细胞。CCK-8结果显示：SK-0V-3细胞的ICso为3.6 mol/L,A2780细胞的ICso是2 2 mol/L,Hey细胞的ICso是18 mol/L,SW626细胞的ICso是8.8 mol/L(图1A）。因此，我们将选用SK-OV-3和SW626细胞进行后续的细胞实验。我们用EGCg处理SK-OV-3和SW626细胞12 h后，检测两种细胞中铁死亡指标的变化。结果发现,相较于对照组,ECCg组卵巢癌细胞Fe?+的浓度升高（图1B），细胞内ROS含量升高（图1C），GPX4的mRNA和蛋白表达下降,NOX1的mRNA和蛋白表达升高（图1D-E）。上述结果说明,EGCg能促进卵巢癌细胞发生铁死亡。ABCD58407SW626口NC口NC5SK-OV-3SK-OV-3*口EGCg口EGCg4NC*A2780*6-30-4-口NC*口EGCg工Hey00口EGCg3SW626*3420*T2250101*0020010300040SK-OV-3SW626SK-OV-3SW626GPX4NOX1GPX4NOX1EGCg(mol/L)E3NCEGCgSW626NCEGCg5SK-OV-3*NC4-口NC*GPX4口EGCgGPX42EGCg3-NOX1NOX12-*GAPDHGAPDH*00SK-OV-3GPX4NOX1SW626GPX4NOX1图1ECCg诱导卵巢癌细胞发生铁死亡A:ECCg对4株宫颈癌细胞（SK-OV-3、A 2 7 8 0、H e y 和SW626）的半数抑制浓度;B:EGCg对SK-OV-3和SW626细胞内Fe2+浓度的影响；C:ECCg对SK-OV-3和SW626细胞内ROS浓度的影响;D-E:ECCg对SK-OV-3和SW626细胞中铁死亡相关蛋白（GPX4和NOX1）的影响。与NC组比较，*P0.01。Fig.1ECCg induces ferroptosis in ovarian cancer cellsA:The ICso of ECCg against four cervical cancer cell lines(SK-OV-3,A2780,Hey and SW626).B:Effects of ECCg on Fe2+concentration in SK-OV-3 and SW626 cells.C:Effects of EGCg on the concentration of ROS species in SK-OV-3 and SW626 cells.D-E:Effects of EGCg on ferropto-sis related proteins(GPX4 and NOX1)in SK-OV-3 and SW626 cells.Compared with NC group,*P0.01.2.2EGCg能抑制AADAC蛋白的表达和活性经过酶活实验发现：EGCg能特异性抑制AADAC重组蛋白的活性,ICso约为（0.7 8 0.0 4）mol/L（图2 A）。为验证EGCg对卵巢癌细胞中AADAC蛋白表达的影响。我们用ECGCg处理SK-OV-3和SW626细胞，2 4h后收获细胞。RT-qPCR结果显示：相对于NC组,ECCg组细胞中AADAC的mRNA水平没有显著变化（图2 B）。W e s t e r n b l o t 结果显示：相对于NC组，EGCg组细胞中AADAC蛋白水平下降（图2C）。接下来我们用CHX和MG132处理SK-OV-3细胞，用于验证EGCg是否通过泛素化途径促进AADAC的降解。实验结果显示：加人EGCg后，AADAC蛋白的降解时间显著提前（图2 D）；加人MG132抑制蛋白的泛素化之后，EGCg不能降低AADAC蛋白的含量（图2 E）。上述结果说明：EGCg能抑制AADAC蛋白的表达活性并促进AADAC蛋白的泛素化降解。2.3AADAC在卵巢癌组织和细胞中普遍高表达为探究AADAC在卵巢癌中的表达情况，我们查阅GEPIA数据库并收集了7 8 例卵巢癌患者的临床石蜡标本。在CEPIA数据库中，AADAC在卵巢癌中高表达（图3A）。免疫组化结果显示：相对于癌旁正常组织，卵巢癌患者组织中AADAC的表达升高（图3B）。为了进一步确定这一结果，我们收集了3对卵巢癌新鲜组织，并检测了AADAC的表达。RT-qPCR和Westernblot结果显示：相对于癌旁正常组织，卵巢癌组织中AADAC在mRNA和蛋白水平均表达升高（图3C-D)2.4沉默AADAC能促进卵巢癌细胞发生铁死亡我们设计了2 条针对AADAC的siRNA，并选用SK-OV-3和SW626细胞进行细胞实验。转染siRNA后，卵巢癌细胞中AADAC的表达显著降低（图4A）。CCK-8 结果显示，沉默AADAC后卵巢癌细胞的增殖能力显著降低（图4B）。由4330.EGCg通过特异性抑制AADAC诱导卵巢癌细胞发生铁死亡蔡月红，等于siA A D A C#2 的沉默效果更好，后续将用该序列进行实验。实验分组：si-NC、s i-A A D A C和si-AADAC+pcDNA3.1-AADAC。铁离子检测结果显示：沉默AADAC后卵巢癌细胞中Fe2+的浓度升高，过表达AADAC能使细胞Fe2+的浓度降低（图4C）。RO S检测结果显示：沉默AADAC后卵巢癌细胞中ROS含量升高，而过表达AADAC能使细胞ROS含量降低（图4D）。W e s t e r n b l o t 结果显示：沉默AADAC后卵巢癌细胞中GPX4蛋白表达下降，NOX1蛋白表达升高，而过表达AADAC能逆转GPX4和NOX1的变化（图4E）。上述结果显示：沉默AADAC能导致卵巢癌细胞发生铁死亡。ABC1.5-1.5150-NCEGCgNCNCE-AO-XSEGCgAADAC口EGCg1001.01.0GAPDHAADACNCEGCg500.5-0.5AADAC*929MS02GAPDH0.0013450.0SK-OV-3EGCg(mol/L)SK-OV-3SW626SW626DEMG132CHXCHX+EGCgTime(h)EGCg06122461224+AADACAADACGAPDHGAPDH图2 ECCg对AADAC蛋白表达和活性的影响A：酶活实验检测EGCg对重组AADAC蛋白活性的影响;B:RT-qPCR检测ECCg对AADAC转录的影响；C:Westermblot检测ECCg对AADAC蛋白含量的影响；D:CHX和EGCg处理SK-OV-3细胞，在0、6、12 和2 4h检测AADAC蛋白的表达;E:MC132和ECCg处理SK-OV-3细胞，2 4h后检测AADAC蛋白的表达。与NC组比较，*P0.05，*P 0.0 1。Fig.2Effects of ECCg on expression and activity of AADAC proteinA:The effect of EGCg on the activity of recombinant AADAC protein was detected by enzyme activity.B:The effect of ECCg on AADAC transcriptionwas detected by RT-qPCR.C:The effect of ECCg on AADAC protein content was detected by Western blot.D:SK-OV-3 cells were treated with ac-tinomycosterone and ECCg,and the expression of AADAC protein was detected at O,6,12 and 24 h.E:SK-OV-3 cells were treated with MG132 andECCg,and the expression of AADAC protein was detected after 24 h.Compared with NC group,*P0.05,*P0.01.A60米50-BNormalTumor1540-*301020-510-00NormalTumor=u)(n=78)(n=78)TumorNormalCD88*664NTNTNT4AADAC22GAPDH00NormalTumorNormalTumor图3AADAC在卵巢癌组织标本中的表达A:GEPIA数据库中AADAC在卵巢癌中的表达;B：免疫组化检测AADAC在卵巢癌组织中的表达（SP200）;C-D:RT-q PCR和Westernblot检测AADAC在3对卵巢癌临床标本中的表达（N：癌旁正常组织,T:癌组织）。与Normal组比较，*P0.05，*P 0.0 1。Fig.3Expression of AADAC in ovarian cancer tissuesA:Expression of AADAC in ovary cancer in GEPIA database.B:Immunohistochemical detection of AADAC expression in ovarian cancer tissues(SP x200).C-D:The expression of AADAC in 3 pairs of ovarian cancer samples was detected by RT-qPCR and Western blot(N:Normal tissue adjacent tocancer,T:Cancer tissue).Compared with normal group,*P0.05,*P0.01.?4331MODERNONCO.31,No.23现代肿瘤医学2023年12 月第31卷第2 3期AB-si-NC-si-AADAC#1si-AADAC#2ON-IS工1.0-工-NCAADACAADAC0.5-*GAPDHGAPDH0.0SK-OV-3SW626SK-OV-3SW626CCDE5257VV-ISON-IS*工si-NC口NCAADAON-420*si-AADAC#si-AADAC3si-AADAC+15-#CPX4GPX4-si-AADAC+pcDNA3.1-工2#pcDNA3.1-AADAC10-AADACNOX1NOX15GAPDHGAPDHSK-OV-3SW6260SK-OV-3SW626SK-OV-3SW626图4沉默AADAC能促进卵巢癌细胞发生铁死亡A：验证2 条siRNA对AADAC的敲低效果;B:CCK-8检测卵巢癌细胞的增殖能力（48 h);C:检测卵巢癌细胞中Fe2+的含量;D:检测卵巢癌细胞中ROS的含量;E：W e s t e r m b l o t 检测铁死亡相关蛋白CPX4和NOX1的表达。与si-NC组比较，*P0.05，*P 0.0 1；与si-AADAC组比较，#P0.05。Fig.4Silencing AADAC can promote ferroptosis in ovarian cancer cellsA:To verify the knockdown effect of two siRNA on AADAC.B:The proliferation ability of ovarian cancer cells was detected by CCK-8(48 h).C:TheFe2+content in ovarian cancer cells was detected.D:The ROS content in ovarian cancer cells was detected.E:The expressions of ferroptosis related pro-teins GPX4 and NOX1 were detected by Western blot.Compared with si-NC group,*P0.05,*P0.01.Compared with si-AADAC group,#P0.05.2.5沉默AADAC能减缓EGCg对卵巢癌细胞的杀伤作用根据前期结果，我们确定ECCg和沉默AADAC均能促进卵巢癌细胞发生铁死亡。但这两者之间是否存在一定联系。于是，我们设计了AADAC的敲除序列并包装成慢病毒。经过单克隆挑选，我们得到了AADAC-KO的卵巢癌细胞系。接下来，我们在AADAC-KO卵巢癌细胞系中加人EGCg并检测相关细胞学指标。我们检测AADAC-KO细胞的ECCg的IC5o，结果发现：两组AADAC-KO细胞的ICso为（2 9.7 2.4)mol/L(SK-0V-3)和(19.8 1.4)mol/L(SW626)（图5A）。相较于空白细胞，AADAC沉默后对EGCg不敏感。CCK-8结果显示：相对于NC组,AADAC-KO组细胞增殖减慢；相对于AADAC-KO组，AADAC-KO+ECCg组细胞增殖没有显著变化（图5B）。铁离子检测结果显示：相对于NC组，AADAC-KO组细胞中Fe2+的浓度升高；相对于AADAC-K