miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖.pdf

现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.213921miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖王芊文2，李文华1-2,逐君霞2,赵彬1-2，耿玉庆12，王小芳1-2，吴向未1-2.3，陈雪玲1.2I国家卫生健康委中亚高发病防治重点实验室，新疆石河子8 32 0 0 0；石河子大学医学院，新疆石河子832000；石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，新疆石河子8 32 0 0 0【摘要】目的：探究脂筱特征蛋白2(Flotillin2,FLOT2）对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响及相关机制。方法：通过ENCORI数据库和细胞功能学实验证实FLOT2在肝癌中的表达情况以及对肝癌细胞生物学行为的影响;TargetScan中检索可能调控FLOT2的miRNA,CancerMIRNome 分析miR-148a-3p在肝癌中的表达和对肝癌患者预后的影响,qRT-PCR和Westerm Blot 检测过表达 miR-148a-3p后肝癌细胞中FLOT2的表达水平,双荧光素酶实验验证miR-148a-3p与FLOT2的靶向调控关系；将细胞分为pcDNA组、pcDNA-FLOT2组以及pcDNA-FLOT2+miR-148a-3pmimics 组,Transwell 实验以及 EdU实验检测三组细胞迁移、侵袭和增殖能力。结果:FLOT2在肝癌中高表达,高表达FLOT2的肝癌患者预后更差,过表达FLOT2增强肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力;miR-148a-3p在肝癌组织中低表达,与肝癌患者预后相关,和FLOT2呈负相关;过表达miR-148a-3p降低FLOT2的mRNA和蛋白水平,双荧光素酶实验表明miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因;过表达miR-148a-3p抑制FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的能力。结论:miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖。【关键词】肝癌;miR-148a-3p;FLOT2;迁移；增殖【中图分类号】R735.7【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 1-392 1-0 7miR-148a-3p targets FLOT2 to promote maligration,invasion and proliferation in hep-atocellular carcinomaWANG QianwenI Wenhua,Junxia,ZHAO Bin,ENG Yuqing,ANG Xiaofang,WU Xiangei-,CHEN Xueling-2Key Laboratory for Prevention and Treatment of Central Asian High Disease,National Health Commission,Xinjiang Shihezi 832000,China;Medical College of Shihezi University,Xinjiang Shihezi 832000,China;Department of Hepatobiliary Surgery,the First AffiliatedHospital of Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi 832000,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t s t h e e f f e c t o f l i p i d r a f t s i g n a t u r e p r o t e i n 2(Fl o t i l i n 2,FLO T 2)o n mi g r a t i o n,invasion and proliferation of hepatocellular carcinoma and related mechanisms.Methods:The expression of FLOT2 inhepatocellular carcinoma and its effect on the biological behavior of hepatocellular carcinoma cells were confirmed bythe ENCORI database and cell functional assays.miRNAs that may regulate FLOT2 were retrieved in TargetScan,andmiR-148a-3p expression in hepatocellular carcinoma and its effect on the prognosis of hepatocellular carcinoma pa-tients were analyzed in CancerMIRNome.qRT-PCR and Western Blot were performed to detect the expression levelof FLOT2 in hepatocellular carcinoma after overexpression of miR-148a-3p.Dual luciferase assay was performed toverify the targeting and regulation of miR-148a-3p and FLOT2.The cells were divided into pcDNA,pcDNA-FLOT2 and pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p mimics groups,and the migration,invasion and proliferation abilitiesof the three groups were measured by Transwell assay and EdU assay.Results:FLOT2 was highly expressed in hepato-cellular carcinoma,and patients with high FLOT2 expression had a worse prognosis.Overexpression of FLOT2 en-hanced the migration,invasion and proliferation of hepatocellular carcinoma cells.miR-148a-3p was lowly ex-pressed in hepatocellular carcinoma tissues,correlated with the prognosis of hepatocellular carcinoma patients,and was【收稿日期】2023 04 07【修回日期】2023-06-27【基金项目】中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助（编号：2 0 2 0-PT330-003）；国家自然地区科学基金项目（编号：8 2 0 6 0 2 97）；兵团指导性科技计划项目（编号：2 0 2 2 ZD041）；兵团财政科技计划项目区域创新引导计划（编号：2021BB006）；石河子大学自主支持科研项目（编号：ZZZC202026A）【作者简介】王芊文（1997），女，黑龙江海伦人，在读硕士，主要从事肝癌发病机制研究。E-mail：12 1332 8 6 6 1 q q.c o m【通信作者】陵陈雪玲（197 1一），女，新疆石河子人，博士，教授，主要从事肝脏疾病的免疫相关机制研究。E-mail:【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.21.0043922negatively correlated with FLOT2.Dual luciferase assay verified that the targeted regulation of FLOT2 gene by miR-148a-3p.Overexpression of miR-148a-3p decreases the mRNA and protein levels of FLOT2.Overexpression ofmiR-148a-3p inhibited the ability of FLOT2 to promote the migration,invasion and proliferation of hepatocellularcarcinoma cells.Conclusion:miR-148a-3p targeted regulation of FLOT2 gene affect the migration,invasion andproliferation of hepatoma cells.Key words hepatocellular carcinoma,miR-148a-3p,FLOT2,migration,proliferation肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球癌症相关死亡的第四大常见原因。多数HCC确诊时已处于晚期,尽早地发现和治疗HCC,能够大大提高患者的生存率2 。因此，寻找新的生物标志物和进一步探究可能的发病机制对于肝癌的诊断和治疗非常重要。脂筏(lipid raft)是细胞膜上直径约为10 2 0 0 nm的微小区域,包括FLOT1、FLO T 2、p r o h i b-itin(PHB)等组成性蛋白,参与细胞膜运输及信号转导等诸多生理过程3。FLOT2 在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，如肝癌、黑色素瘤、肺癌、胃瘤等4-7 。但是，调控FLOT2基因表达的上游机制并不十分清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类大小为192 2 个核苷酸的非编码小RNA8。通常情况下,miRNA对靶基因具有负向调控作用,可以降解靶基因或抑制靶基因翻译。miRNA也与癌症的发病机制有关,充当肿瘤抑制因子或癌基因9。本研究证实了高表达的FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力,多种数据库筛选得到可能调控 FLOT2 基因的miR-148a-3p,结合细胞功能学实验发现miR-148a-3p影响肝癌细胞的生物学功能,并与FLOT2 基因表达量呈负相关,双荧光素酶实验验证了miR-148a-3p与 FLOT2基因的靶向调控关系。总而言之，我们的研究揭示了调控FLOT2基因影响肝癌细胞恶性生物学行为的潜在上游作用机制,为临床研究提供新的治疗靶点。1材料与方法1.1材料人肝癌五种细胞系（Huh7、H e p G 2、M H CC97 H、SNU 38 7、Hep3B)均来自中科院上海细胞典藏委员会;Transwell小室、细胞培养瓶、细胞培养板及培养皿、冻存管、离心管购自Cor-ning公司;RNA提取试剂盒购自OMEGA公司；逆转录试剂盒购自Thermo公司;EdU试剂盒购自APEBIO公司；双荧光报告基因检测系统检测盒来自上海吉玛公司；Tween-20、1.5MTris-HCL(pH=8.8）、30%丙烯酰胺、甲醇、逆转录仪来自Takara公司;qRT-PCR仪来自BioRa d 生物工程公司；多功能酶标仪来自TECAN公司;FLOT2抗体来自Abcam公司;过表达质粒均购自上海吉玛公司;qRT-PCR引物购自上海生工公司；倒置显微镜来自日本（OLYMPUS）；二氧化碳培养箱来自American ThermoScientific公司。1.2方法1.2.1细胞培养和转染Huh7、H e p G 2、M H CC97 H 使用DMEM完全培养基；SNU387和Hep3B使用MEM完全培养基。使用Lipofectami-ne7M3000进行质粒转染，将2 10 个细胞接种在10 0 0 L含血清无双抗的完全培养基内，细胞汇合度达到8 0%至90%时加入质粒及转染试剂；取2.5LLipofectamineTM3000加到10 0 L DMEM 中;取2.5L pcDNA-FLOT2及其对照pcDNA3.1,加到含有5LP3000试剂的10 0 LDMEM中,王芊文，等miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖Modern Oncology 2023,31(21):3921-3927混匀；将LipofectamineTM3000混合物与质粒混合物慢慢混匀（此时总体积为2 0 0 L）,室温孵育15min。孵育期间,从培养箱中取出提前铺好细胞的12 孔板，用1PBS清洗2 次后加8 0 0 L无血清的DMEM培养基。孵育完成后，向每孔加人转染混合物，缓慢摇晃孔板，使混合液在孔中均匀分布。将细胞培养板置于细胞培育箱中培养2 4至48 小时后，可进行后续试验。1.2.2Transwell检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力检测细胞侵袭能力需要预先将稀释好的Matrigel基质胶加入到每个小室中，置于培养箱中使其凝固。开始实验前，向上室中加入50 L无血清培养基水化基底膜；完成水化后,将350 L细胞悬液(310 5个细胞)加入上室,在下室中加人8 0 0 L含有10%FBS的完全培养基。随后,将2 4孔板置于培养箱中,培养2 4小时。从培养箱中取出小室,吸去上室内液体,将小室放到4%的多聚甲醛中固定；0.1%结晶紫染液染色15分钟；1PBS漂洗数次至无多余染料，用棉签轻轻擦掉上室细胞，风干小室；倒置显微镜下拍照，选取随机3个高倍镜视野计数并取平均值,统计学分析。细胞迁移实验步骤同细胞侵袭实验，但上室中不需要基质胶。1.2.3EdU检测肝癌细胞的增殖能力细胞转染完成后,加人稀释好的EdU工作液,孵育3小时。去除工作液,每孔中加人1mL4%的多聚甲醛，室温下固定15分钟。去除固定液，每个孔用1mL含3%BSA的PBS洗涤细胞。去除洗涤液，向每个孔中人1mL含0.5%TritonRX-100的PBS（简称通透液）后，室温孵育2 0 分钟。去除通透液,用1mL含3%BSA的PBS洗涤每孔中的细胞。去除洗涤液，每孔中加人0.5mL提前配置好的Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保Click反应液均匀分布覆盖样品，室温避光孵育30 分钟。吸去Click反应液,用1mL含3%BSA的PBS洗涤每孔。加入1mL1Hoechst33342溶液,避光孵育30 分钟后，用PBS洗涤每孔。荧光显微镜下观察染色情况，拍照计数。1.2.4qRT-PCR检测FLOT2表达量及细胞转染效率实验前准备：按引物说明书加人无酶水溶解引物，混匀备用；采用试剂盒法提取RNA及逆转录。逆转录程序如下：Reaction buffer 4 L+Block RI 1 L+dNTP 2 L+RT 1 L。扩增程序如下：上、下游引物各0.8 L+5.4L无酶水+3L cDNA+10 uL SYBR,引物序列见表1。miRNA的逆转录需要加入特异性逆转录引物，根据miRNA引物套装说明书进行实验。1.2.5WesternBlot检测FLOT2蛋白表达水平选择10%的分离胶和5%的浓缩胶进行蛋白电泳；电泳结束后根据目的蛋白分子量的不同设置电转时间，电转结束后将PVDF膜置于5%BSA中室温封闭3小时。置于1：1000稀释的一抗（兔抗人FL0T2）中，4摇床过夜孵育。现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期1TBST清洗3次,10 min/次。置于1:10 0 0 0 稀释的二抗（羊抗兔IgG）中室温孵育1小时；1TBST清洗3次,10min/次。按试剂说明书要求配制发光底物，发光底物覆盖PVDF膜后，使用自动曝光机曝光。1.2.6双荧光素酶报告基因检测验证miRNA 和FLOT2的结合按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求操作。在9 6 孔板中加入50 L细胞裂解液。分别将10 L萤火虫荧光素酶反应液和10 L海肾荧光素酶反应液加人孔板中，混匀。酶标仪上检测其活力，检测时间尽量控制在半小时内。1.3统计学处理采用GraphPad8.0.2软件对数据进行处理和统计学分析。P0.05表示差异具有统计学意义，用*表示；P0.01,用*表示；P0.001，用*表示。Tab.1Primer sequencesGenePrimer sequencesFLOT2For:5-TGGAGATGGCGGGAGCTG-3Rev:5-TCACTTTCTTCTTCTCTTTGCTGC-3-actinFor:5-AACCGCGAGAAGATGACCCAG-3Rev:5-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3miR-148a-3pFor:CAGAGCTCTCAGTGCACTACAGARev:TATGGTTGTTCACGACTCCTTCACU6For:CGCTTCGGCAGCACATATACRev:TTCACGAATTTGCGTGTCATC2结果2.1过表达 FLOT2促进 MHCC97H肝癌细胞的生物学功能通过ENCORI检索发现,肝癌组织中FLOT2的表达水平比癌旁组织更高，高表达FLOT2的肝癌患者总体生存率更低（图1）。qRT-PCR检测实验室常见的五种肝癌细胞中FLOT2的mRNA表达水平,其中MHCC97H中FLOT2表达量最低（图2 A）。采用质粒转染使MHCC97H细胞高表达FLOT2基因（图2 B）。通过Transwell 以及EdU实验比较pcDNA组和pcDNA-FLOT2组细胞的迁移、侵袭和增殖能力,结果显示pcDNA-FLOT2 组细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强(图2 C-D)。2.2miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因miRNA能通过干扰靶基因编码蛋白质,进而调控肝癌细胞的生物学行为。通过TargetScan数据库检索可能调控FLOT2的miRNA,结果显示miR-148a-3p可能会靶向调控FLOT2基因（图3A）。在CancerMIRNome以及ENCORI数据B50normal samples inLIHC1.00Data Source starBasev3.0 projectP=5.6e-13FDR=5.0e-12Cancerlog2(FPKM)Nommal log2(FPKM)Box plot oGene exprsions图1FLOT2在肝癌组织中的表达情况(A)以及肝癌患者预后的关系(B)Fig.1 Expression of FLOT2 in liver cancer tissues(A)and its relationship with the prognosis of HCC patients(B)MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.21库中探索肝癌组织和正常组织中miR-148a-3p的表达情况,结果显示 miR-148a-3p在肝癌组织中低表达,并与FLOT2 的表达量呈负相关,且与肝癌患者预后不良有关（图3B-D)。采用miR-148a-3pmimics转染MHCC97H细胞,qRT-PCR和Western Blot 检测显示miR-148a-3p mimics组（简称miR-148a-3p组)细胞中FLOT2的mRNA 以及蛋白水平均下降（图3E-F）。同时，双荧光素酶报告实验证实了miR-148a-3p和FLOT2的靶向调控关系（图3G）。2.3miR-148a-3p抑制FLOT2对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的作用上文的结果提示miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因，接下来通过Transwell以及EdU实验验证miR-148a-3p对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响。结果表明,miR一148a-3p组相比 miR-NC 组细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显减弱（图4）。将 MHCC97H细胞分为pcDNA组、pcDNA-表1引物序列FLOT2 组和 pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p 组。qRT-PCR结果显示,与 pcDNA-FLOT2组相比,pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p组FLOT2的mRNA水平明显降低（图5A）。Transwell以及EdU实验检测以上三组细胞迁移、增殖和侵袭能力。结果显示,pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p组的迁移、侵袭和增殖能力明显减弱（图5B-C)。3讨论肝癌在癌症相关死亡病因中排名第三位,在全球最常见癌症中排名第六位，肝癌发病率呈逐年上升趋势，对人体健康构成严重威胁10 。多数HCC患者确诊时已处于晚期，丧失手术机会，且预后较差，总生存率（overall survival rate，0SR)仅为10%18%,对于无法切除的中晚期肝癌患者可供选择的治疗方式非常有限(I-12。因此，寻找作为肝癌早期诊断并且能够监测肝癌预后的生物标志物，,是现如今研究的重点。脂筱特征蛋白2（Flotillin2,FLOT2）是一种高度保守、普遍表达的蛋白，它位于细胞膜内侧,存在于胞质中富含胆固醇的特定微域内5。它参与调控多种癌症的发生发展过程。有报道表明,FLOT2 的过表达与大肠癌、肺腺癌和胃癌的恶性进展有关9,13-14。参与多种癌症的发生发展过程,FLOT2通过调节细胞周期和诱导 EMT促进HCC 的肿瘤生长和转移5。FLOT2 可以通过与 EPHA2 相互作用促进胶质瘤的生长和转移,不仅如此FLOT2还通过调节细胞周期和诱导上皮间充质转化促进HCC进展。实际上，FLOT2的下游机制已经得到了广泛研究和报道,然而调控FLOT2表达的上游机制鲜有相关报道。因此，寻找调控FLOT2基因影响肝癌进展的潜在上游机制具有重要意义。AFLOT2with374cancerand3923Overllsurvival forFLOT2 inLIHCcancerLog-RankP=0.0025Lownum=1850.75Highnum=184Hazardratio-i.710.50Group-High0.25-Low+(High,1)+(Low,1)0.00025550751000125Time(months):3924:王芊文，等miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖A8642HCC97HHep*7-ynHCTranswellmigrationassay(x100)pcDNAPCDNA-FLOT2Hep3250200150100500*水BTranswellinvasion assay(x100)5432*0250-pcDNAPCDNA-FLOT2200-150100500peDNAXPLOYANA150HoechestD-VNGodA:FLOT2在五种细胞中的本底表达量;B:qRT-PCR检测过表达FLOT2转染效率;C:Transwell实验检测两组细胞的迁移和侵袭能力（结晶紫染色);D:EdU实验检测两组细胞的增殖能力。A:Background expression of FLOT2 in five types of cells.B:qRT-PCR to detect the transfection efficiency of overexpressed FLOT2.C:Transwell assayto detect the migration and invasion ability of two groups of cells(crystal violet staining).D:EdU assay to detect the proliferation ability of two groups of cells.EdU图2 过表达FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力Fig.2 Overexpression of FLOT2 promotes migration,invasion and proliferation of HCC cellsAPosition1169-1175ofFLOT23UTR5h5a-miR-148n-3pBP=3.00e-0818-MergePredicted consequential pairing oftargetsitetypeContext+Context+scoreWeightedConservedbranchregion(top)andmiRNA(bottom)context+scorepercentile.CUGGGGCUUGGAUGUUGCACUGCUGUUUCAAGACAUCACGUGACU1.00-1.75-*100500DNPredictedPscorelongthI7mer-m8CNAFLOT2relativeK,-0.1883-0.18Dhas-miR-148a-3p vs.FLOT2.370 samples(LIHC)Date Source:starBasev3.0 project4.2880.55-3.929P-4.15e-12614-NormalSampletypeE1.51.00.50.00.50-0.25-Highexpression(n-186)expression(n=1860.00HR=0.58(0.41-0.82)Pvalue=2.20e-03Tumor0306090120Overall survival(months)F*FLOT2(45 kD)Tubulin(55 kD)3P12Has-miR-148a-3p,expressionlevel:log2(RPM+0.01)G1.MHCC97H1.0miR-NC_miR-148a-3p0.50.014-mimicsNcmiR-148a-3pmimics161820Fig.3miR-148a-3p targets and regulates FLOT2FLOT2MUTmiR-148a-3图3miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因A:TargetScan数据库检索显示miR-148a-3p可能会靶向调控FLOT2基因;B-D:CancerMIRNome以及ENCORI数据库中检测显示miR-148a-3p在肝癌组织中低表达,并与 FLOT2 的表达量呈负相关,且与肝癌患者预后不良有关;E:qRT-PCR 检测过表达 miR-148a-3p后FLOT2的mRNA水平;F:过表达miR-148a-3p后FLOT2的蛋白表达水平;G:双荧光素酶报告实验证实miR-148a-3p和FLOT2的靶向调控关系。A:TargetScan search showed that miR-148a-3p may target and regulate FLOT2 gene.B-D:Detection in CancerMIRNome as well as ENCORI data-base showed low expression of miR-148a-3p in HCC tissues and negative correlation between FLOT2 expression and poor prognosis of hepatocellularcarcinoma patients.E:qRT-PCR detection of FLOT2 mRNA levels after overexpression of miR-148a-3p.F:Protein expression levels of FLOT2 afteroverexpression of miR-148a-3p.G:Dual luciferase reporter assay confirmed the targeting and regulation relationship between miR-148a-3p andFLOT2.现代肿瘤医学2023 年11月第31卷第2 1期A Transwell migration assay(100)miR-NCMODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.21Transwell invasion assay(100)3925.miR-NC150100-miR-148a-3p500-miR-NCmiR-148a-3p*100-8060miR-148a-3p40200miR-NCmiR-148a-3p*250-BHoechestEdUMerge200-5003图4miR-148a-3p抑制肝癌细胞迁移、侵(A)(结晶紫染色)和增殖(B)能力Fig.4miR-148a-3p inhibits the ability of HCC cells to migrate,invade(A)(crystal violet staining)and proliferate(B)abilityA6-4-2-B(001)HL600HNTranswell migration assay(x100)C*工2Hoechest-pcDNAPCDNA-FLOT2-pCDNA-FLOT2pcDNApcDNA-FLOT2Transwell invasion assay(100)pcDNApcDNA-FLOT2EdUMerge+miR-148a-3pPCDNA-FLOT2+miR-148a-3p150=pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p*￥10050-050*一PCDNA40=PCDNA-FLOT230pcDNA-FLO12+miR-148a-3p20100250*200150100500OT2A-FLOPeDNA-F2+miR-148a-3图5miR-148a-3p过表达逆转FLOT2对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响A:qRT-PCR检测三组细胞FLOT2的mRNA表达水平;B:EdU实验检测三组细胞的增殖能力;C:Transwell 实验检测三组细胞迁移和侵袭能力（结晶紫染色）。Fig.5 Effect of miR-148a-3p overexpression on reversal of FLOT2 on migration,invasion and proliferation ability of hepatocellular carcinoma cellsA:qRT-PCR to detect the mRNA expression level of FLOT2 in the three groups of cells.B:EdU assay to detect the proliferation ability of the threegroups of cells.C:Transwell assay to detect the migration and invasion ability of the three groups of cells(crystal violet staining).3926微核糖核酸（miRNAs）是一种小的非编码RNA,大约有22个核苷酸,miRNA作为基因表达的调节器通过靶向调节下游基因的表达发挥作用15。越来越多的证据表明，异常的miRNAs在调节瘤症的发生中起着关键作用16 。miRNA通过与靶信使RNA（mRNA）的3非翻译区（UTR）部分互补结合，在转录或转录后调节蛋白质的表达，能作为肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、骨肉瘤、结直肠癌等多种癌症治疗的潜在靶标17-19。也有研究表明,miRNA可作为原发性肝瘤，尤其是有乙肝病毒感染史患者原发性肝癌的诊断标志物2 0 。而miR-148a-3p参与调节细胞生长和调亡,在多种癌症中（如胰腺癌、乳腺癌和肺瘤)被确定为重要调节因子2 1。然而,miR-148a-3p-FLOT2轴是否参与了肝癌进展的调节仍需要进一步研究。为了探究这一潜在机制，本研究采用质粒成功在MHCC97H细胞中过表达了 FLOT2,与对照组相比 FLOT2过表达组肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显提高。使用在线数据库筛选出可能调控FLOT2并且在肝癌中有预后意义的miR-148a-3p。通过miRNA模拟物过表达miR-148a-3p,显示miR-148a-3p能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过双荧光素酶实验结合挽救实验证实FLOT2受miR-148a-3p靶向调控影响肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。综上所述,FLOT2可能是通过miR-148a-3p的调控影响肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力,这为肝癌的治疗提供可能靶点。但本文只通过细胞水平验证了miR148 a-3p 靶向FLOT2影响肝癌的恶性行为,未来可以在动物模型中进一步探究，从而为提高肝癌患者预后提供更可靠的理论依据。1 YANG JD,HAINAUT P,GORES GJ,et al.A global view of hepato-cellular carcinoma:trends,risk,prevention and management J.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2019,16:589-604.2XING MT,WANG XZ,KIKEN RA,et al.Immunodiagnostic bio-markers for hepatocellular carcinoma(HCC):the first step in de-tection and treatment J.Int J Mol 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