DB51∕T 2906-2022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范(四川省).pdf

ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 29062022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范 Technical specification for isolation and identification of swine gaeta virus 2022 - 05 - 20 发布 2022 - 07 - 01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 29062022 I 目次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语 . 1 5 试剂与设备 . 1 主要试剂 . 1 5.1 主要仪器设备 . 2 5.2 6 样品的采集、保存与运输 . 2 猪只临床发病特征 . 2 6.1 临床样品的采集 . 2 6.2 保存与运输 . 2 6.3 7 病毒的细胞分离培养 . 2 生物安全措施 . 2 7.1 样品的处理 . 2 7.2 单层细胞制备 . 2 7.3 接种细胞 . 2 7.4 病毒收获 . 3 7.5 8 病毒核酸 RT-PCR 鉴定 . 3 核酸提取和反转录 . 3 8.1 RT-PCR 扩增 . 3 8.2 9 结果判定 . 4 RT-PCR . 4 9.1 病毒分离鉴定 . 4 9.2 附录 A（规范性） 试剂配制 . 5 附录 B（资料性） 猪源盖塔病毒 CAP 基因扩增序列 . 6 DB51/T 29062022 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。 本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。 本文件主要起草人：陈斌、朱玲、钟攀、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国华、李莎莎、吉色曲伍、孙贤刚、江朝源。 本文件首次发布。 DB51/T 29062022 1 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法。 本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHK-21：乳仓鼠肾源细胞 CPE：细胞病变 DMEM：细胞营养液 DNA marker：DNA相对分子质量标记 FBS：胎牛血清 GETV：盖塔病毒 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 PBS：磷酸缓冲液 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 5 试剂与设备 主要试剂 5.1 5.1.1 所用生化试剂均为分析纯。 5.1.2 实验用水应符合 GB/T 6682 一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。 5.1.3 BHK-21、DMEM 培养基、FBS、HEPES 缓冲液(1mol/L 储存液)、0.01 mol/L pH 7.07.4 PBS(参见附录 A)；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 反应混合液（2 ）。 DB51/T 29062022 2 主要仪器设备 5.2 微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。 6 样品的采集、保存与运输 猪只临床发病特征 6.1 新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、 日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状时， 均可认为疑似猪盖塔病毒感染。 临床样品的采集 6.2 采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约2g5g或血液样品1 mL2 mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中待检。 保存与运输 6.3 采集的样品应按照 NY/T 541（所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室。样品在2 8 条件下保存不超过24 h；若超过24 h，放置低于-20冰箱，不宜反复冻融。 7 病毒的细胞分离培养 生物安全措施 7.1 GETV分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB 19489（所有部分）的规定执行。 样品的处理 7.2 7.2.1 组织样品 取0.5 g1 g待检组织样品，加入1mL1.5mL PBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4 3000 r/min离心10 min，取上清液，以0.22m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5 mL离心管中，-70 保存备用。 7.2.2 血液样品 用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，3000 r/min离心10min，取上清液，以0.22 m无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5 mL离心管中，-70 保存备用。 单层细胞制备 7.3 按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8% FBS的DMEM培养基5 mL，细胞浓度应为2 105个/mL3 105个/mL，培养48 h。 接种细胞 7.4 DB51/T 29062022 3 取制备后的组织样品或血液样品上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层BHK-21细胞上 （5mL工作体积）。每份样品接种2瓶4瓶细胞，另设细胞对照2瓶4瓶。37 C吸附1 h，弃上清，加入2ml含2% FBS的DMEM培养基，37 、5% CO2条件下培养48h。 病毒收获 7.5 每天观察记录CPE，通常在接种12h48 h内可出现CPE，感染BHK-21细胞后约12h，细胞出现空洞；24h后细胞明显变圆，部分开始脱落；36h后大量脱离，贴壁细胞大部分变圆。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4 3000 r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70 保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传， 即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液， 37 培养12h48h。盲传3代，再进行鉴定。 8 病毒核酸 RT-PCR 鉴定 核酸提取和反转录 8.1 采用RNA提取试剂盒提取处理后的临床样品或收集到的细胞/病毒液核酸， 或用自动化核酸提取仪提取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20保存备用。 RT-PCR 扩增 8.2 8.2.1 引物 引物针对GETV CAP基因保守区域。上游引物（10mol/L）：5-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3； 下游引物（10mol/L）：5-GCACTCRAGGTCATACTTG-3，扩增产物大小为316 bp。 8.2.2 反应体系 反应体系见表1，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。 表1 RT-PCR 反应体系 PCR反应试剂 体积(L) 2TaqPCRmaster Mix 5 上游引物（10 mol/L） 0.5 下游引物（10 mol/L） 0.5 cDNA模板 1 ddH2O 3 8.2.3 反应程序 反应程序见表2。 表2 RT-PCR 反应程序 步骤 时间和温度 循环数（个） 预变性 5 min、95 1 变性 30 s、95 35 退火 30 s、56 延伸 30 s、72 延伸 7 min、72 1 DB51/T 29062022 4 8.2.4 琼脂糖凝胶电泳成像 取适量扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。 9 结果判定 RT-PCR 9.1 示例1：阳性对照出现大小为 316 bp 的特异性扩增条带，阴性对照无条带，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照大小一致的特异性扩增条带，则判定为 GETV 核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩增条带，则判定为 GETV 核酸阴性。 病毒分离鉴定 9.2 9.2.1 对核酸阳性扩增产物进行测序，其结果与附录 B.1 序列比对，进行确认。 9.2.2 细胞发生 CPE、 GETV RT-PCR 结果为阳性， 且测序比对结果正确， 则判定为 GETV 分离鉴定阳性。 9.2.3 若盲传 3 代后，细胞并未发生 CPE，但核酸鉴定结果为阳性，则继续盲传至 5 代后，再进行核酸检测，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为 GETV 分离阳性；若核酸鉴定结果为阴性，则判定为 GETV 分离鉴定阴性。 9.2.4 若盲传 3 代后，细胞并未发生 CPE，核酸鉴定结果为阴性，则判定为 GETV 分离鉴定阴性。 DB51/T 29062022 5 A A 附录A （规范性） 试剂配制 A.1 0.01mol/L pH7.0-7.4 PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO412H2O 3.58g KH2PO4 0.27g 灭菌双蒸水 800mL NaOH或者HCl调pH值7.0至7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4备用。 A.2 电泳缓冲液 TAE（50 倍） 三羟甲基甲烷碱（Tris base） 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA） 100mL 蒸馏水 100mL 待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。 A.3 1.0%琼脂糖凝胶板制备 琼脂糖 1.0g 1 TAE缓冲液 100mL 0.5ug/mL溴化乙锭 5uL 微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。 DB51/T 29062022 6 B B 附录B （资料性） 猪源盖塔病毒 CAP 基因扩增序列 B.1 猪源盖塔病毒 CAP 基因扩增序列 ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGATAAAGTGATGAAGCCGGCACACGTCAAAGGTGTGATCGACAACCCCGACCTAGCGAAGCTTACCTACAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGC