EBER原位杂交手工检测常见问题与对策.pdf

网络出版时间：网络出版地址：原位杂交手工检测常见问题与对策施洋关键词：；原位杂交；手工检测中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：接受日期：作者单位：江苏省镇江市第一人民医院病理科，镇江 作者简介：施洋，男，副主任技师。：病毒（，）属于疱疹病毒，在人群中普遍存在感染，一旦原发感染康复后会转变为终身潜伏状态。随着对 的深入研究，我们发现它与许多肿瘤的发生有关 。原位杂交检测可在分子层面上确认 与肿瘤之间的关联，是检测 相关肿瘤的金标准。目前，多数大型医院 原位杂交检测已使用全自动免疫组化染色仪，鉴于中小型医院受场所、资金、人员等因素的限制，手工操作方法依然是首选。本科室根据实际工作对 原位杂交（试剂盒购自北京中杉金桥公司）手工检测过程中出现的问题、原因及应对措施进行详细分析，取得良好效果，现报道如下。酶消化前 组织固定不良 组织轻度固定不良导致信号定位不准确原因：离体组织经充分及时地固定能够最大限度的保存细胞内核酸的完整性，保持 的稳定性。有时候因固定温度、时间、试剂浓度、组织大小等因素的影响，导致组织出现轻度固定不良的现象，使组织细胞核结构松散，原本定位细胞核内的 在细胞内出现弥散，导致信号定位不准确影响最终判读（图）。对策：离体组织需在室温环境下 内进行固定，固定液建议使用 中性缓冲福尔马林（）。活检组织固定时间 ，大组织固定时间 ，一般建议不超过 ，长时间甲醛固定组织对核酸会有较大的破坏作用，同时也会产生甲醛色素干扰最终结果判读。组织严重固定不良导致无信号表达原因：严重固定不良的组织发生自溶，组织结构完全破坏，细胞核碎裂溶解，和 丢失殆尽，无法进行 检测。这一情况大多数是人为造成的，如组织未添加固定液或用错试剂配置甲醛固定液等。对策：加强人员岗位技能培训，制定完善的科室管理制度，建设科室质量安全管理团队 ；配置试剂时，“取、配、弃”三个环节要做到三核查，可以最大限度避免配图 组织固定不及时导致信号定位不准确错试剂的可能。组织脱蜡不干净导致信号表达强度下降甚至假阴性原因：组织脱蜡不干净会较大程度的影响酶组织消化效果，同时也会造成探针的穿透结合效率下降，导致最终信号表达减弱或不表达。对策：检测要单独使用二甲苯脱蜡，脱蜡时间控制为 。脱蜡液要根据实际工作定量、定期更换以保证脱蜡质量，通常情况下脱蜡超过 张切片或使用 天就要进行脱蜡液更换，尤其在南方地区湿度较大，更换需更加频繁。酶消化前组织干燥不彻底导致信号表达强度下降原因：首先，胃蛋白酶消化对 值的变化较为敏感，它需在 才具有较高的活性，而干燥不充分会导致残留的水分改变了消化环境的 值，在滴加胃蛋白酶后影响酶活性，造成组织消化不彻底；其次，由于胃蛋白酶的空间结构使其在一定程度上表现有疏水特性，在组织含有水分的情况下影响酶的穿透与消化能力，也会造成组织消化不完全。对策：每次实验前更换无水乙醇保证其纯度，并且多次浸泡切片达到充分脱水的要求；延长组织干燥时间，通常在空气中放置 就能达到较好的干燥效果。杂交前 蛋白酶消化不足导致信号表达减弱原因：蛋白酶消化效果受众多因素的影响，如蛋白酶种类选择不当、消化时间过短、消化温度过低、切片偏厚等均会导致蛋白酶不能完全消除靶核酸周围的杂蛋白，将其核酸序列完全暴露出来，影响了组织的通透性，不利于探针渗透并进行充分杂交（图）。对策：采用胃蛋白酶在 恒温环境下 厚组织切片消化 ，组织厚度每增加 消化时间增加 。由于组织过厚会导致消化时间难以控制，组织消化不充分，且组织细胞大量重叠会影响阳性定位判读，一般建议临床与实验病理学杂志 ；（）组织厚度不超过 。蛋白酶消化过度导致组织结构松散信号分布不均原因：过度消化一般是在消化温度和时间上把控不好造成的，这种情况往往在使用蛋白酶 后时有发生。蛋白酶 是一种强力蛋白溶解酶，在 使用时要严格控制消化时间，操作过程中稍有不慎就会导致消化过度（图 ）。对策：建议使用消化能力相对稳定平和的胃蛋白酶，在操作过程中控制好消化时间。最新文献报道改良 检测方法中使用 代替蛋白酶 ，也取得了较好的消化效果，并且可以提高杂交信号 。图 蛋白酶消化不足导致信号表达减弱图 消化过度造成组织松散信号分布不均 杂交前组织干燥不彻底导致杂交信号减弱原因：组织干燥不彻底，组织内含有的水分会稀释了滴加微量的探针浓度，往往会导致杂交率下降。对策：同前一次组织干燥方法。杂交中 探针效价下降造成信号减弱或无信号原因：探针效价下降往往是因为保存条件不符合要求造成的，或探针超过有效期限。对策：工作液保存在 冰箱，使用时要即拿即放，减少在外界停留时间；对于浓缩液需分装置于 保存，用多少取多少，避免反复冻融。存放探针的冰箱要建立冷链系统，严格监控冰箱温度；同时要建立完善的试剂管理体系，做到专人专管，并记录好试剂到货、使用、过期的时间，在试剂上贴有相应时间标识，避免试剂过期使用。杂交条件选择不恰当导致信号表达不稳定原因：原位杂交的过程就是带有标志物的探针与靶序列按照碱基配对互补的原则进行特异性杂交过程，其受很多因素的影响，尤其是组织层面。杂交前不同组织的状态是不一致的，不同组织细胞核内病毒拷贝数也不确定，杂交时间达不到要求往往会导致信号强度下降；不稳定的温度、湿度也会使杂交率发生波动，造成不稳定的结果。对策：采用原位杂交仪 杂交 ，充足的杂交时间能够满足不同病毒拷贝数的组织，另一方面原位杂交仪的使用可为杂交过程提供稳定的环境，同时操作简单，与恒温培养箱相比具有明显的优势。盖玻片封片时有气泡造成局部组织无信号表达原因：组织表面有杂质，盖玻片表面有异物，探针滴加过少，这些原因都是导致气泡处探针无法进入细胞核内并与靶序列杂交（图 ）。对策：充分洗涤去除组织表面杂质；盖玻片选择硅化处理过的，提高表面清洁度；探针滴加量根据组织大小来适当增减。橡胶水泥封边不到位导致非特异性背景原因：橡胶水泥封边不全会造成杂交过程中探针干燥，与组织发生非特异性结合，在 冲洗中很难洗脱而造成背景染色（图 ）。对策：橡胶水泥封边后将玻片放在 原位杂交仪上晾干，待橡胶水泥彻底干燥后仔细观察封边情况，如有遗漏可进一步添加补充。图 杂交时探针分布不均导致信号杂乱，部分组织不表达图 探针干燥后出现局灶性强背景 杂交后 缓冲液洗涤不彻底导致非特异性染色：组织切片洗涤不充分会造成探针、抗体在组织内部残留，形成非特异性结合而造成背景着色（图 ）。对策：延长每一步 洗涤时间至 ，同时 缓冲液每次使用前需重新配制，加入 。我们发现加入 可以有效地降低载玻片的表面张力，有利于试剂在组织上延展；有利于洗脱未结合的探针、抗体等 减少非特异性背景产生；实验中我们还发现它还可以在一定程度上增加组织的通透性，有利于探针的穿透杂交。图 冲洗不足导致非特异性背景临床与实验病理学杂志 ；（）实验对照的设立为确保实验结果的可靠性，在操作过程中需要设立实验对照，这也是 检测实验室质量控制的重要手段。根据操作规范要求，每次检测 时均需设立阴、阳性对照，对试剂造成一定的浪费。手工操作的影响因素是针对每一张组织切片，因此利用组织芯片技术可以最大限度的满足 检测实验对照的需求。通常我们在每张组织切片充分烤片后将多余的组织擦掉，然后在近靶目标侧裱上芯片组织再次烤片。有文献报道，利用对照组织制作组织切片匀浆液也能达到较好的对照效果，且该方法制作简单，组织用量少，阳性信号稳定 。综上所述，手工检测影响因素众多，为此需要建立一套完整并符合规范的操作制度和操作流程以保证实验室质量安全，同时实验室工作人员还需要经过专业的培训，操作时认真负责，严格遵循操作规范，得到安全可靠的 实验室结果。参考文献：全国儿童 病毒感染协作组，中华实验和临床病毒学杂志编辑委员会 病毒感染实验室诊断及临床应用专家共识 中华实验和临床病毒学杂志，（）：马恒辉，周晓军病理实验室质量控制与安全管理团队建设 临床与实验病理学杂志，（）：林蓁，杨文圣 全自动免疫组化预处理仪在改良 原位杂交检测中的应用 临床与实验病理学杂志，（）：何小艳，吴宁，孟红，等防止免疫组化切片干燥的新方法 诊断病理学杂志，（）：丁伟，王波，徐黎明液态阳性对照在 病毒编码小 原位杂交染色质量控制中的应用 中华病理学杂志，（）：网络出版时间：网络出版地址：病例报道主动脉瓣二瓣化合并冠状动脉开口畸形和粥样硬化猝死 例刘希，王悦，李广云，刘明哲，陈新山关键词：先天性心脏病；主动脉瓣二瓣化；冠状动脉开口畸形；猝死中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：死者女性，岁，尸长 ，发育正常，体形消瘦。腹部呈轻度舟状腹外观，双手十指甲床轻度紫绀；体表未见明显损伤。尸体检查眼观：心脏质量 、大小 ，心脏表面未见异常，各心房、室腔未见明显异常，主动脉瓣仅见两个瓣膜（图 ），左冠瓣和右冠瓣融合为一个瓣膜，瓣膜稍增厚、质地稍硬，瓣膜联合处亦增厚、质硬，但瓣膜未见明显的变形和关闭不全，两个瓣膜缘长均为 ，余各心瓣膜、腱索和乳头肌未见明显异常。各心室壁厚度：左室壁 ，右室壁 ，室间隔 ；各瓣膜周径：二尖瓣 ，主动脉瓣 ，三尖瓣 ，肺动脉瓣 。冠状动脉检查：左、右冠状动脉开口均位于同一主动脉窦内（图 ），相距 、直径分别为接受日期：作者单位：广东金域司法鉴定所，广州 作者简介：刘希，男，本科。：陈新山，男，博士，教授，博士生导师，通讯作者。：和 ；左、右冠状动脉走形未见异常，左主干长 ；左前降支和右主支见动脉粥样硬化，管腔狭窄病变程度均为级，左主干和左旋支未见明显狭窄病变。余器官未见明显异常。镜检：左心室心外膜下脂肪组织稍增多，局部见灶性淋巴细胞浸润；心肌间质血管淤血、局部纤维结缔组织增多，有的部位形成灶性瘢痕（图 ），可见少量淋巴细胞浸润，有的小动脉管壁明显增厚；大部分心肌纤维断裂，部分心肌纤维呈轻度波浪样变；右心房心外膜下脂肪组织和心肌间质均见灶片状出血，右心室前壁心肌间质见少量脂肪组织。冠状动脉左前降支和右主支管壁内膜呈环形增厚，斑块内见较多脂质沉着，管腔狭窄分别约为 和 （图 ）；房室结间质纤维结缔组织稍增多。其他除见肺水肿及多器官不同程度淤血等非特异性病变和自溶等死后变化外，未见严重的病理形态学变化。病理诊断：主动脉瓣二瓣化（，）畸形；冠状动脉开口畸形；冠心病（冠状动脉左前降支和右主支管腔狭窄病变级）。毒物检测：被鉴定人心血中未检出常见毒（药）物成分。死亡原因：综合分析认为符合因患 合并冠状动脉开口畸形和粥样硬化致猝死。讨论本例被鉴定人主动脉瓣只有两个瓣膜，左冠瓣和右冠瓣融合为一个瓣膜，瓣膜稍增厚、质地稍硬，瓣膜联合处亦增厚、质硬，且左、右冠状动脉开口均位于同一主动脉窦内，可明确诊断为 畸形和冠状动脉开口畸形。是成人最常见的先天性主动脉瓣畸形，占 ，也是主临床与实验病理学杂志 ；（）