金黄色葡萄球菌及其检验课稿.ppt

金黄色葡萄球菌及其检验,1,、,金黄色葡萄球菌的生物学特性,2,、金黄色葡萄球菌的抗原构造及分型简介,3,、金黄色葡萄球菌的致病性,4,、金黄色葡萄球菌的流行病学,5,、金黄色葡萄球菌的检验方法,6,、金黄色葡萄球菌肠毒素的检测,7,、金黄色葡萄球菌的快速检测方法,8,、金黄色葡萄球菌污染的控制,一、金黄色葡萄球菌的生物学特性,1,、,形态与染色,：,(staphylococcus aureus),典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径,0.8m,左右，显微镜下排列成,葡萄串状,。,金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。,革兰氏染色阳性,。,金黄色葡萄球菌的生物学特性,2,、,培养特性,：,金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度,37C,，最适生长,pH 7.4,。,平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径,1-2mm,。血平板菌落周围形成透明的溶血环。,金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在,10-15%NaCl,肉汤中生长。,附：,金黄色葡萄球菌平板菌落照片。,金黄色葡萄球菌的生物学特性,3,、,生化特性：,可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，,VP,反应弱阳性。,许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。,金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。,二、,金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型,（简介）,对分型进行简单的了解,、,血清学分型：,金葡水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。,蛋白抗原是凝集抗原，无特异性。,多糖抗原有特异性。,绝大多数金葡含有,A,型抗原，,B,型抗原主要存在于凝固酶阴性菌株，,C,型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。,、噬菌体分型：,、根据肠毒素分型：,、根据血浆凝固酶分型：,三、金黄色葡萄球菌的致病性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,金黄色葡萄球菌的致病性,金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶,：,a.,溶血毒素,：外毒素，分,、,、,、,四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；,b.,杀白细胞素,：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；,c.,血浆凝固酶,：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；,d.,脱氧核糖核酸酶,：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；,e.,肠毒素,：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,及,F,五种血清型。,当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经,8-10,小时即可相当数量的肠毒素。,肠毒素可耐受,100C,煮沸,30,分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。,此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。,四、金黄色葡萄球菌的流行病学,金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，,50%,以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。,近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。,金黄色葡萄球菌的流行病学,金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：,季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率,83%,，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。,一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：,食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。,金黄色葡萄球菌的流行病学,金黄色葡萄球菌肠毒素,是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的,33%,，加拿大则更多，占,45%,，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件：,存放温度，在,37C,内，温度越高，产毒时间越短；,存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；,食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,食品卫生微生物学检验 五、金黄色葡萄球菌检验方法,1,主题内容与适用范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。,2,引用标准,GB 4789.28-2003,食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂,3,设备和材料,(,略,),4,培养基和试剂,(,略,),5,检验程序,(,略,),金黄色葡萄球菌检验方法,定性试验,定量检测（,Baird Parker,平板法）,金黄色葡萄球菌检验方法,6,操作步骤,6.1,增菌培养法,6.1.1,检样处理称取,25g,固体样品；吸取,25mL,液体样品，加入,225mL,灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。,6.1.2,增菌及分离培养吸取,5mL,上述混悬液，接种于,7.5%,氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤,50mL,培养基内，置,361,温箱培养,24h,，转种血平板和,Baird,Parker,平板，,361,培养,24h,，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。,6.1.3,形态本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为,0.5,1m,。,6.1.4,在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在,Baird,Parker,平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为,2,3mm,，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,6.1.5,血浆凝固酶试验吸取,14,新鲜兔血浆,0.5mL,，放入小试管中，再加入培养,24h,的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物,0.5mL,，振荡摇匀，放,361,温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察,6h,，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。,6.2,直接计数方法,6.2.1,吸取上述,1,：,10,混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液,1mL,，分别加入三块,Baird,Parker,平板，每个平板接种量分别为,0.3mL,、,0.3mL,、,0.4mL,，然后用灭菌,L,棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在,361,温箱,1h,，等水分蒸发后反转平皿置,361,温箱培养。,6.2.2,在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选,5,个菌落，分别接种血平板，,36124h,培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。,6.2.3,菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以,5,，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。,金黄色葡萄球菌检验方法,用,3 mm,接种环,从有细菌生长的各管中移取,1,环,划线接种于表面干燥的,Baird-Parker,琼脂平板,置,361,培养,45,48h,。,怎样在平板上进行细菌的划线分离。,1.,斜线法,2.,曲线法,3.,方格法,4.,放射法,5.,四格法,金黄色葡萄球菌的单个菌落在,Baird-Parker,琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿 润,直径,2,3mm,。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色,(,非白色,),的边缘,周围绕以不透明圈,(,沉淀,),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分 解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。,金黄色葡萄球菌在,BP,平板上的菌落形态,金黄色葡萄球菌血浆凝固酶,按血浆凝固酶的机理不同可分两种,结合凝固酶：又称凝聚因子，是一种结合菌体细胞壁的酶，直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白而使葡萄球菌凝集成块。于该酶存在菌体表面，故可用玻片法测之。,分泌型凝固酶：是游离于菌体外的游离凝固酶，类似凝血酶原样物质，不直接作用于血浆纤维蛋白原而是和一种凝固酶反应因子结合形成一种稳定复合物。该复合物具有凝血酶样活性作用于纤维蛋白原而使血浆凝固。因此该酶只能用试管法检测。,金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验,取肉汤培养物,0.3mL,同,0.5mL,凝固酶试验兔血浆于,8mm100mm,试管内充分混合,置,361,培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察,6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。,六、,金黄色葡萄球菌肠毒素的检测（简介）,一、动物学试验：主要用幼猫和猴。,二、血清学试验：,肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。,用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有：,免疫琼脂扩散法,反向间接血凝试验,免疫荧光法,酶联免役吸附法,七、,金黄色葡萄球菌快速检测方法（简介）,目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。比如：法国梅里埃公司生产的,RPF,试剂盒、,API,检测系统等。梅里埃公司生产的,miniVIDAS,利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上,45,分钟可以得到结果。,附：,梅里埃公司生产的,miniVIDAS,比如：美国,3M,公司生产的金黄色葡萄球菌快速检测试片，可以直接计数产生耐热核酸酶的金黄色葡萄球菌，操作简单，缩短了时间。,原理,应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（,ELFA,）抗原（细菌、蛋白）的检测是应用一种夹心的技术，包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。,测试范围,用以食品及环境样本中的致病菌包括：沙门氏菌、李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、葡萄球菌肠毒素、大肠埃希菌,O157,、弯曲菌、免疫浓缩沙门氏菌、免疫浓缩大肠埃希菌,O157,。,八、金黄色葡萄球菌污染的控制,防止金黄色葡萄球菌污染食品,防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至,-10,以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。,防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成,应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过,6,小时，并且食用前要彻底加热。,