HPLC-CAD分离测定山楂不同炮制品中熊果酸和齐墩果酸.pdf

炮制制剂34Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(4)中药与临床HPLC-CAD分离测定山楂不同炮制品中熊果酸和齐墩果酸杨璐嘉2，张传洋12，王丽娟 2，曾利，李雪敏，邓放1.2*摘要 目的：建立HPLC-CAD法同时测定山楂不同炮制品，同分异构体熊果酸、齐墩果酸含量差异的方法。方法：色谱柱采用ThermoScientificAccucoreTMCis柱（10 0 mm3mm，2.6 m），以0.5%醋酸铵水（A）-乙（B）-甲醇（C）(21：6 1：18）为流动相，流速0.3mLminl，柱温2 5；电喷雾式检测器（CAD）参数：采集频10 Hz，雾化温度35C，滤波为10 s。结果：熊果酸、齐墩果酸分别在0.0 0 19 0.119 6 mgmLl（r=0.9 9 8 2）、0.0 0 2 9 0.0 9 2 0 mg：mLl（r=0.9 9 8 2）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为10 0.7 5%、9 8.9 5%，RSD值分别为2.9 1%、2.31%；且炒山楂中熊果酸、齐墩果酸的平均含量均较焦山楂、山楂炭的含量高。结论：建立的HPLC-CAD法可同时分离测定山楂不同炮制品中熊果酸、齐墩果酸含量，该方法稳定可靠，重现性好，为其检测分析和质量控制提供了新的方向。关键词 山楂；炮制品；HPLC-CAD；熊果酸；齐墩果酸中图分类号 R282.1文献标识码 A文章编号 16 7 4-9 2 6 X(2023)04-006-03Determination of isomeric ursolic acid and oleanolic acid in different processed products of Shanzha by HPLC-CAD/YANG Lu-jia*,ZHANG Chuan-yang,WANG Li-juan2,ZENG Li,LI Xue-min,DENG Fang/(1.School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 61l137,Sichuan;2.State Key Laboratory of Southwestern ChineseMedicine Resources,Chengdu 611137,Sichuan)Abstract Objective:To establish a method for simultaneously detecting the differences in the contents of isomeric ursolicacid and oleanolic acid in diferent processed products of Shanzha using HPLC-CAD.Method:A Thermo Scientifc AccucorerMCis column(100 mmx3 mm,2.6 m)was used with 0.5%ammonium acetate water(A)-acetonitrile(B)-methanol(C)(21:61:18)as mobile phase,flow rate 0.3 mL-min,column temperature 25 C.The charged aerosol detector(CAD)parameters were asfollows:10 Hz for sampling rate,35 C for the nebulizer temperature,and 5 s for filter.Result:Ursolic acid and oleanolic acidshowed good linearity in the ranges of 0.00190.1196 mgmLl(r-0.9982)and 0.00290.0920 mgmL(r-0.9982),respectively,with the average spiked recoveries of 100.75%and 98.95%.The RSD values were 2.91%and 2.31%,respectively.And the averagecontents of ursolic acid and oleanolic acid in fried Shanzha were higher than those in charred Shanzha and Shanzha charcoal.Conclusion:The established HPLC-CAD method can simultaneously separate and detect the contents of ursolic acid and oleanolicacid in different processed products of Shanzha.This method is stable,reliable,and exhibits good reproducibility,providing a newdirection for the detection,analysis,and quality control of Shanzha.Key words Shanzha;processed products;HPLC-CAD;ursolic acid;oleanolic acid山楂是一种应用较为广泛的药食同源植物，其来源于山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果实，具有健胃消食、行气散瘀、化浊降脂的功效。基金项目 成都中医药大学“杏林学者学科人才科研提升计划(0 30 0 550 6 2)作者单位 1.成都中医药大学药学院，2.西南特色中药资源国家重点实验室，四川成都6 11137作者简介 杨璐嘉，女，硕士，助理实验师，主要研究方向：中药药效物质基础与质量标准研究Tel:18108252184E-mail:通讯作者 邓放，男，博士，副教授，主要研究方向：中药药效物质基础与质量标准研究Tel:136840903833E-mail:收稿日期 2 0 2 3-0 2-14相关药理研究表明，山楂中的三酸类化合物：熊果酸、齐墩果酸等，具有显著的降血脂、降血压等药理活性，其作用机制也得到广泛研究2-3。目前对熊果酸、齐墩果酸的分析检测主要采用高效液相色谱法，检测器常用紫外检测器（UV），但这类化合物在化学结构上没有强的紫外吸收基团，只有较弱的末端吸收，紫外检测效果较差4。电喷雾检测器（CAD）是一种新型的通用型检测器，其具备灵敏度强、重现性好、线性范围宽等特点，近年来在药学研究中得到了广泛应用；且其响应值的高低仅与待测物的质量浓度有关，而与待测物的化学性质等无关，因此适用于分析检测存在弱紫外吸收、或者不存在紫外吸收的化学成分5-6 。本研究拟建立35Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)中药与临床HPLC-CAD法，旨在同时分离比较山楂不同炮制品中熊果酸、齐墩果酸含量，并为山楂不同炮制品的质量标准提升研究提供科学依据。1仪器与试药1.1仪器Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪、DAD-3000RS检测器、CoronaVeo电雾式检测器（ThermoFisherScientificInc.）；BS12 4S万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精密度万分之一）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）1.2试药对照品熊果酸（批号：wkq21111602；纯度98%；四川维克奇生物科技有限公司）、齐墩果酸（批号：0 2 0 0 0 30 0 1；纯度9 8%；四川普西奥标物科技有限公司）；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品公司），醋酸铵（分析纯，成都市科隆化学品公司），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），乙（色谱级，美国Fisher公司）。炒山楂饮片（批号2 10 9 0 2；安徽惠丰国药有限公司）、焦山楂饮片（批号2 2 0 10 1，安徽惠丰国药有限公司）、山楂炭饮片（批号2 10 50 4，安徽康和中药科技有限公司），饮片均经成都中医药大学药学院龙飞副教授鉴定为蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的干燥成熟果实。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Thermo Scientific AccucoretTMCi：色谱柱（10 0 mm3mm，2.6 m）；流动相：流动相A为0.5%醋酸铵水，流动相B为乙腈，流动相C为甲醇，按照A：B：C=2 1：6 1：18 的比例等度洗脱；流速：0.3mLmin；进样量：5L；柱温：2 5C；C A D 检测器雾化温度35，过滤常数10.0 s，采集频率10Hz。2.2溶液制备各取熊果酸、齐墩果酸对照品，精密称定，加甲醇适量以溶解，并定容至10 mL，摇匀，即得浓度分别为0.59 8 0、0.46 0 0 mgmL的对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液，梯度稀释为不同浓度的混合对照品溶液（熊果酸浓度分别为0.119 6、0.0598、0.0 2 9 9、0.0 145、0.0 0 7 5、0.0 0 37、0.0 0 19mgmL，齐墩果酸浓度分别为0.0 9 2 0、0.0 46 0、0.02300、0.0 115、0.0 0 58、0.0 0 2 9 m g m L）。各取炒山楂、焦山楂、山楂炭粉末（过2 号筛）约1.0 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加人甲醇2 5.0 mL，称定质量，超声30 min（40 k H z，150W）后，重新称定质量，根据减失的质量进行补足，取样经0.2 2 m微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。2.3CAD、D A D 检测器比较取逐级稀释后的对照品溶液，各进样5L，分别在“2.1”项的相同色谱条件下，采用CAD、D A D检测器分析，计算信噪比（S/N）为3时的浓度为检测限，信噪比（S/N）为10 时的浓度为定量限。结果见表1。表1CAD、D A D 检测限、定量限比较CADDAD检测器熊果酸齐墩果酸熊果酸齐墩果酸检测限0.280.361.031.54(g mL-l)定量限0.941.181.912.87(g mL-I)由表1可知，与DAD检测器相比，CAD检测器在测定熊果酸、齐墩果酸时检测限、定量限更低，即具有更高的灵敏度。2.4系统适应性试验根据“2.1”项下色谱条件所测的2 种成分，均与相邻色谱峰的分离度大于1.5，且与其他组分分离完全，拖尾因子在0.9 5 1.0 5，理论塔板数大于6 0 0 0，色谱系统适用性试验符合含量测定要求。具体见图1。2ABCD02468101214t/min图1对照品、供试品的HPLC-CAD图A.混合对照品；B.炒山楂；C.焦山楂；D.山楂炭；1.齐墩果酸；2.熊果酸2.5线性关系试验取逐级稀释后的对照品溶液，各进样5L，按“2.1”J项中条件测定，以进样浓度为横坐标(X),36：中药与临床PharmacyandCChineseMateria Medica2023;14(4)tnlcs峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2，线性关系良好。表2 山楂中熊果酸、齐墩果酸的线性关系(n=6)成分回归方程线性范围(mgmL:)熊果酸Y-19.331X+1.15680.99820.00190.1196齐墩果酸Y=18.054X+0.80830.99820.00290.09202.6精密度试验取同一混合对照品溶液，连续测定6 次，测得熊果酸、齐墩果酸的RSD值分别为0.45%、0.34%，表明仪器精密度良好2.7稳定性试验精密称量山楂炭炮制品粉末，制备供试品溶液，分别于0、1、2、8、10、12 h进行测定，记录峰面积。结果熊果酸、齐墩果酸峰面积的RSD值分别为1.7 2%、2.2 6%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。2.8重复性试验称取6 份山楂炭炮制品粉末约1.0 g，精密称定，按“2.2 项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测得山楂炭炮制品中熊果酸、齐墩果酸的平均含量分别为3.7 7 0 9、0.7 0 8 5mgg，R SD 值分别为2.2 5%、1.6 1%。2.9加样回收率试验称取6 份山楂炭炮制品样品粉末约0.5g，精密称定，分别加入适量熊果酸、齐墩果酸对照品，制备为加样后的供试品溶液。按“2.1”项下分析条件进样测定，计算加样回收率。结果见表3。表3加样回收试验结果(n=6)平均回成称样量样品含量加人量测得量回收率RSD收率分(g)(mg)(mg)(mg)(%)(%)(%)0.50301.99741.97343.9939101.170.50091.98901.97343.9883101.310.50011.98591.97343.930796.76熊果华0.50201.99341.97344.0794103.78100.752.91酸0.50181.99261.97344.000299.880.50061.98791.97343.8667101.600.50300.36640.36800.727698.160.50090.36490.36800.727498.51齐墩果酸0.50010.36430.36800.727598.710.50200.36570.36800.7338100.0498.952.310.50180.36550.36800.7468103.610.50060.36470.36800.713394.732.10样品含量测定取各批次山楂不同炮制品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，“2.1”项条件下测定，平行进样3次，记录峰面积，采用外标法计算熊果酸、齐墩果酸的含量。结果见表4。表4含量测定结果(n=3)供试品平均含量RSD供试品平均含量RSD成分成分批号(mg:g)(%)批号(mg:gl)(%)2109024.34970.642109020.81560.74熊果齐墩2201013.76740.722201010.68972.78酸果酸2105043.79970.532105040.69942.943讨论3.1检测器选择本实验比较了相同液相条件下，Ci：色谱柱联合不同类型检测器（DAD、C A D）测定二者含量的方法7。结果表明，DAD检测法中，检测波长为2 10 nm时，色谱图中平行进样中2 个目标成分积分面积偏差较大（重复性实验中RSD为6.5%），特别对于含量较低的齐墩果酸影响更为显著。3.2色谱条件选择本研究中分别比较了不同系统和比例的流动相，如乙腈-0.5%醋酸铵水溶液梯度洗脱、甲醇-0.5%醋酸铵水溶液梯度洗脱、0.5%醋酸铵水-乙腈-甲醇（2 1：6 1：18，V：V）等度洗脱等8-10 。考虑到梯度洗脱较复杂，且分析时间过长，选择0.5%醋酸铵水-乙腈-甲醇（30：35：35，V：V）等度洗脱为初始色谱条件，但检测过程中发现分离效果不佳，且出峰时间较长，经反复摸索，调整为0.5%醋酸铵水-乙腈-甲醇（2 1：6 1：18，V：V）。结果熊果酸、齐墩果酸的分离度良好，且供试品溶液的整体分析时间也较为快速合理。3.3不同山楂炮制品中2 个成分含量变化由表4可知，不同山楂炮制品样品间熊果酸、齐墩果酸的含量差异为：炒山楂 焦山楂 山楂炭。现有研究表明，山楂四种炮制品：生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭，均是通过热加工而成，炮制温度对山楂中脂溶性三酸几乎没有显著影响，因此随着炮制过程热加工程度的提高，山楂炮制品中熊果酸、齐墩果酸的含量可能将不再呈现差异性变化3.4方法评价本研究中所建立的HPLC-CAD法操作简便、快速、灵敏、准确，可用于山楂不同炮制品中熊果酸、齐墩果酸的含量测定及质量控制。(下转第41页）（责任编辑：傅舒）上接第36 页）（责任编辑：傅舒）中药与临床41Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)Plants,2022,11(16).3 Yao Y,Sun L,Wu W J,et al.Genome-Wide Investigation ofMajor Enzyme-Encoding Genes in the Flavonoid MetabolicPathway in Tartary Buckwheat(Fagopyrum tataricum)J.Journal of Molecular Evolution,2021,25(3):1-18.4勾秋芬.苦荞资源的开发利用研究.粮食流通技术，2 0 18,000(019):69-71.5何伟俊，曾荣，白永亮,等.苦荞麦的营养价值及开发利用研究进展.农产品加工学刊,2 0 19,0 0 0(0 12)6 9-7 5.6左光明.苦养主要营养功能成分关键利用技术研究D.贵州大学,2 0 0 9.7 Girish VM,Liang H,Aguilan JT,et al.Anti-bioflm activity of参考文献1中国药典2 0 2 0 年版.一部S.2020:33-34.2封若雨,朱新宇,张苗苗.近五年山楂药理作用研究进展.中国中医基础医学杂志,2 0 19,2 7 3(5):153-156.3张洪坤,郭长达,黄玉瑶等.山楂炮制过程中药效物质成分的变化规律研究J中药材,2 0 17,40(4):8 11-8 15.4付亚玲,高琳,张东旭等.齐墩果酸和熊果酸提取、分离与测定方法研究进展.食品研究与开发,2 0 2 0,41(2):19 6-19 9.5袁明昊,魏噶玲,刘红梅等.电雾式检测器在中药分析中的应用.中成药,2 0 2 1,43(7):18 52-18 57.6李心怡,蒋运斌,马逾英.电喷雾检测器在药物HPLC分析中的优势及应用进展J.中国药房,2 0 17,2 8(15):2 152-2 156.7】毛玲,韦国兵,叶雾等.HPLC法同时测定山楂提取物中齐墩果酸和熊果酸的含量J.药学实践杂志,2 0 16,34(6):537-garlic extract loaded nanoparticles.Nanomedicine.2019,04(12).8黄晓霞.负载姜黄素的玉米醇溶蛋白一阴离子多糖核/壳型纳米输送系统的制备及生物活性研究D.广东药科大学,2 0 16.9王亚伟分子相互作用对玉米醇溶蛋白负载体系影响的研究D.浙江大学,2 0 19.10 Yang F,Yang Q,Chen M,et al.Toxic metal ion sequestra-tion by amyloid-mediated fast coacervationJ.Cell ReportsPhysical Science,2021,2(3):100379.539,555.8】李瑶芳,刘明颖,邓双炳等.HPLC法测定不同产地山香圆叶中齐墩果酸和熊果酸的含量J.江西中医药大学学报,2 0 2 2,34(3):7 3-7 6.9杨元丰,刘鑫，谭舒舒等.HPLC测定不同采收期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量J江西中医药大学学报,2 0 18,30(6):7 8-8 0,115.10 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