细胞传代冻存复苏步骤.doc

准备工作：
1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30-50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。
2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出，室温放置一段时间

注意事项：
1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。
2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
开始工作：
1、实验前换衣帽，开风淋，吹风。
2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。
7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。
8、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性，促进消化。
9、取待用细胞，取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。
11、离心5min，1000转/min。
以下分别介绍：
一 换液
1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
4、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。
5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。
7、将细胞置于5%CO2、37度培养箱培养。
二 传代
1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量，加入离心管中，将细胞重悬、吹匀。
2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中，培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞，镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。
三 冻存
1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。
2、按胎牛血清：DMSO=9:1的比例配制冻存液，装入青霉素瓶中。
3、用移液管将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。
4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口，标签。
5、冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱1小时，然后放置-20度冰箱2小时，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌中保存。
四 种板
1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。
2、取培养瓶及小烧杯各一只，摆放好。
3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
4、先移取2ml，5ml，20ml完全培养液,分别加入到离心管，培养瓶，小烧杯中。
5、混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶，吹散细胞。镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。（细胞传代目的）
6、取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约10μl），弃掉枪头，滴入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数），镜下观察细胞数（每个象限5个细胞，总和20个细胞，5×104个），不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。
7、取1个96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下。
8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约100μl），依次滴入96孔板中（枪头至孔下1/3处），同时用移液枪吸取完全培养液（约100μl）作为对照或调零，边缘孔用无菌PBS填充。
9、滴完后，仍用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周。
10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培养箱中进行培养。

五 MTT实验
1、接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl。
2、称取3mg MTT粉末，加6ml完全培养液，配制成浓度5%的MTT溶液，0.22μm的微孔滤膜除菌。
3、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
4、培养3－5天后，取出96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下。
5、用（120μl）移液枪小心吸弃孔内培养上清液（包括调零孔内的培养上清液），弃去枪头。再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包括调零孔，但边缘孔除外（枪头在孔上1/3处）。
6、呈色：继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，置摇床上振荡10分钟，使结晶物充分融解。
7、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

六 复苏
1、准备工作：开启恒温水浴锅，将温度调节在37℃，取一离心管，加入5ml细胞培养基。
2、取出冻存管，立即放入水浴锅中快速摇晃，让冻存液迅速融化。
3、用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。
4、打开冻存管，将冻存液小心转移到预先加入有培养基的离心管中，800rpm离心5分钟。
5、小心弃掉上清，加入约5ml培养基重悬细胞。
6、将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。

换液，传代实验用材：
牛奶瓶2个---PBS缓冲液，DMEM培养基
血清瓶1个---胰蛋白酶
换液：移液管2个
传代：培养瓶1个，移液管3个，离心管1个
MTT实验用材：
试剂：MTT粉，PBS缓冲液，完全培养液，二甲亚砜（DMSO）
器材：96孔板，移液管，移液枪，烧杯，青霉素瓶若干，小滤器，微孔滤膜除菌，酶联免疫检测仪。

清单：
牛奶瓶1个，
血清瓶2个，
培养瓶3个，
移液管5个，
离心管2-3个。