白细胞的检测方法.doc

第四章 白细胞检验的基本方法
第一节 白细胞功能的检验
一、墨汁吞噬试验
【目的】 掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】 墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。
【材料】
1．器材 试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
2．试剂
（1）肝素：配成6U/ml水溶液。
（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。
（3）瑞氏染液等。
【方法步骤】
1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。
3．置37℃温育4h。
4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。
5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
6．判断结果 根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：
阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
(++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
(+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
(++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
7．计算吞噬率及吞噬指数
吞噬率（%）= ×100%
吞噬指数=
【注意事项】 肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。
【参考范围】
成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；
成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
【临床意义】 临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。
二、白细胞吞噬功能试验
【目的】 掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】 白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。
【材料】
1．器材 接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。
2．试剂
（1）制备菌液：取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L pH6.4）洗2次，沸水浴15～20min灭菌。将灭活菌液混悬于20% FCS-RPMI1640培养液中，用比浊法调整细胞浓度至5×1010/L，置4℃备用。
（2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆萨染液等。
【方法步骤】
1．于微量细胞培养板孔内（或小试管内）加100U/ml肝素1滴，无菌采集末梢血3滴，与孔内抗凝剂立即混匀。
2．向孔内（或小试管内）加白色葡萄球菌悬液3滴，混匀。
3．置有盖湿盒内，37℃温育30min，每10min轻摇一次。
4．用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。
5．镜检计数 油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率（%）= ×100%
吞噬指数=
【注意事项】
1． 所用器材要清洁。
2． 抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。
3． 要严格掌握吞噬的时间和条件。细菌与细胞比例以1∶1～10为宜。
4． 涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。
5．计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。
6．本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准确计数吞入的细菌颗粒，应认真识别。
7．应根据各室的具体方法建立本室参考范围，以便客观地判定被测标本中性粒细胞的吞噬能力。
【参考范围】
吞噬率：健康人为61.4～64.2%。
吞噬指数：健康人为1.01～1.11。
【临床意义】 白细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本试验可作为判断机体白细胞功能状态，诊断白细胞本身所致疾病的参考。
1．吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。
2．吞噬率和吞噬指数降低，见于机体免疫功能低下；营养、代谢、肿瘤等因素致白细胞分化不良或不成熟，如粒细胞性白血病，多发性骨髓瘤等；机体存在明显抑制白细胞的因素，如免疫抑制剂、抗白细胞抗体等。
三、血清溶菌酶活性试验
【目的】 掌握血清溶菌酶活性试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】 血清溶菌酶活性试验（serum lysozyme activity test），是利用溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞壁裂解，用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。
（一）平板打孔法
【材料】
1．器材 接种环、毛细滴管、无菌打孔器（孔径5mm左右）、水浴箱、测量尺等。
2．试剂
（1）等渗缓冲液(pH 6.4)：A液：磷酸二氢钾9.07g，氯化钠5.0g，溶于1 000ml蒸馏水中。B液：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)23.87g，氯化钠5.0g，蒸馏水加至1000ml。A液、B液以10∶3比例混合，调至pH6.4。
（2）制备溶壁微球菌： ① 制备营养琼脂斜面培养基：取琼脂4.3g，加牛肉浸膏1.0g，蒸馏水100ml，浸10min后煮沸，使其完全溶解，倒入若干大试管，加塞，高压消毒15min，取倾向位室温冷却，置4℃冰箱保存，备用； ② 接种：溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面培养基上传代一次，试验前按常规接种微球菌于斜面，置37℃培养24～48h，即可长出黄色菌落；③ 制备细菌悬液：用无菌蒸馏水洗下菌苔，2000r/min离心30min，弃上清。再加蒸馏水轻轻混匀，2000r/min离心30min，弃上清，称沉淀物湿重，用无菌蒸馏水配成100g/L的浓菌液（菌液应在临用前配制，不宜存放过久），70～80℃加热灭菌，备用。
（3）1%琼脂：称琼脂粉1g，加入1/15mol/L pH 6.4 PBS 100ml。
（4）溶菌酶标准液：取溶菌酶标准品，用1/15mol/L pH 6.4 PBS制成5、25、100mg/L稀释液。
（5）被检血清。
【方法步骤】
1．制备溶壁微球菌琼脂平板 取已配制好的菌液1ml，加到50～60℃已溶化的1%琼脂中，摇匀，倾注平板（直径7～9cm平板加1%琼脂15ml），待冷凝。
2．打孔 用打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，孔间距18~20mm，用牙签挑去孔内琼脂。
3．加样 用毛细滴管吸取血清，加入琼脂孔内。同时在另一孔内加满溶菌酶标准液作为阳性对照。
4．温育 置25～30℃温育18～24h，观察结果。
5．制备标准曲线 在每批测定同时，将各种浓度的溶菌酶标准液加入小孔中，同上法测定溶菌环的直径。在半对数纸上，以溶菌酶浓度为纵坐标（对数坐标），溶菌环直径为横坐标，绘制标准曲线。从曲线上查出每毫升待检品所含溶菌酶的微克数。
6．判断结果 加血清孔和溶菌酶标准液孔周围的溶壁微球菌被溶解，可见圆形透亮区，即溶菌环。溶菌环的直径大小与溶菌酶的含量成正比。
【注意事项】
测量标准品与待检样品溶菌现象的间隔时间应尽量缩短，最好能在同一块板上备有标准品的对照，以便比较。

（二）比浊法

【材料】

1．器材 接种环、试管、721型分光光度计、水浴箱、微量移液器等。

2．试剂

（1）等渗缓冲液(pH 6.4)：同平板打孔法

（2）制备溶壁微球菌：同平板打孔法。将制备的菌液过滤，取上清液于分光光度计600nm波长处，以缓冲液调零，调节菌液浓度使其光密度为0.4，冰箱保存。

（3）制备溶菌酶标准液：称取干燥溶菌酶2mg，用pH6.4的等渗缓冲液溶解，其酶浓度为lmg/ml(1000μg/ml)，储存液置冰箱保存，备用。溶菌酶应用液则取0.1ml溶菌酶储存液加4.9ml缓冲液，稀释50倍，其酶含量为20μg/ml。

【方法步骤】

1．将菌液置37℃水浴中预温2min。

2．抽取患者血液，分离血清，按表4-1进行操作。

表4-1 溶菌酶测定步骤

加入物 标 准 管 菌液对照管 测定管

1 2 3 4 5 6

微球菌液(m1) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

缓冲液（μ1） 20 40 60 80 100 一

溶菌酶应用液(μ1) 80 60 40 20 一 一

(每隔1min加入)

血清(μ1) 100

混匀，每管于37℃水浴中准确温育10min，取出即加反应终止液

5mol/L NaOH(ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

3．以缓冲液调零，600nm波长处比浊，检测各管的光密度。

4．计算 -

5．制备标准曲线 以测得各标准管的光密度为纵坐标，各标准管所含标准酶浓度为横坐标（第1管含酶16μg/ml，依次为12μg/ml，8μg/ml，4μg/ml），菌液对照管的光密度为零点，在坐标纸上画一曲线。

6．根据标准曲线查出被测血清样品所含溶菌酶的量。

【注意事项】

1．菌液4℃保存比较稳定。溶菌酶标准液以高浓度4℃保存为佳。

2．每批溶菌酶样品的测定须同时作标准管与菌液对照管的测定。

3．血清标本4℃保存10d，酶活性基本不变。

4．该法可同时用于测定尿中的溶菌酶活性，但要收集24h尿量，并加防腐剂，所得结果乘以尿量。

5．该法只适用于测定较窄浓度范围的溶菌酶，因此，测定前应先将待检样品的浓度作适当调整，使之适用于限定的测定范围。

6．细胞溶菌酶测定 血和离心后的菌液各1滴，混合后制成涂片，置含湿纱布玻皿内，于37℃温育30min，干燥后瑞氏染色、镜检。细胞周围菌少，变细、变淡，并可见透明环为阳性。

【参考范围】 血清5～15mg/L；尿0～2mg/L。

【临床意义】 人体血清中的溶菌酶，主要来自血中的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞含量最多。在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞，其溶菌酶的含量可随细胞的成熟程度而增高。在嗜酸性粒细胞，除中幼阶段外，其余均无此酶。淋巴细胞中含量极低。血清和血浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。白血病患者血清溶菌酶含量的变化很大，与其细胞类型有密切关系。

1．增高 主要见于急性髓细胞白血病：①AML-M5其血清溶菌酶含量明显增高，因外周血中成熟单核细胞增多导致溶菌酶释放增多所致，且增高程度与成熟单核细胞多少有关。尿溶菌酶含量也增高，故尿溶菌酶阴性可排除AML-M5的诊断。②AML-M4其血清溶菌酶含量也明显增高，其增高程度与白细胞总数有关。在治疗前其含量明显高，表示细胞分化程度较好，预后亦较好。③急性粒细胞白血病，其血清溶菌酶的含量可正常或增高，临床意义与急性粒-单细胞白血病相似。急粒和急单在治疗缓解，白细胞减少时，其含量也同时下降，但在复发时上升。

2．减低或正常 ①ALL其血清溶菌酶含量多数减低，少数正常；②CML其血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。

四、硝基四氮唑蓝还原试验

【目的】 掌握硝基四氮唑蓝还原试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】 硝基四氮唑蓝还原试验(nitroblue tetrazolium reduction test)，是观察中性粒细胞对硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)还原作用的试验。NBT是一种染料，其水溶液呈淡黄色。当被吞入或渗入中性粒细胞后，有产生过氧化物酶的作用，并可接受己糖旁路代谢途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用产生的NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲月替（formazan）颗粒，并呈点状或斑块状颗粒沉淀于胞质内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比，借此反映中性粒细胞的杀菌功能。

【材料】

1．器材 小试管、滴管、载玻片、水浴箱、显微镜等。

2．试剂

（1）0.15mol/L pH7.2磷酸缓冲葡萄糖生理盐水(PBGS)：取0.15mol/L Na2HPO4溶液7.6ml，0.15mol/L KH2PO4溶液2.4ml及0.15mol/L NaCl 10ml，混匀，加20mg葡萄糖，溶后过滤分装，8磅高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

（2）NBT试剂：取NBT l0mg，加入生理盐水5ml。室温振摇1h溶解(NBT难溶，亦可置80℃水浴中摇动或搅拌助溶)，滤去少数不溶性颗粒后，小量分装，此即贮存液，4℃可保存3～6个月。用时取需要量与等量PBGS混匀即为NBT试剂。

（3）肝素溶液：无防腐剂肝素注射液，用生理盐水稀释成1.25×105U/L。

（4）10g/L沙黄(safranin)水溶液：取沙黄1g，先加l～2ml 95%乙醇助溶，然后边振荡边加蒸馏水使之溶解成l00ml。滤纸过滤后，室温避光保存。

（5）甲醇等。

【方法步骤】

1．取一小试管，加肝素溶液0.05ml，再加受检者外周静脉血0.5ml，混匀。

2．取抗凝血0.1ml与等量NBT试剂在小试管内混匀，盖住管口。置37℃温育25min，中间振摇1次，再置室温15min。

3．轻轻摇匀细胞，用滴管吸出1滴于载玻片上，推成涂片，立即吹干。甲醇固定2～3min，吹干。10g/L沙黄水溶液染色5min，水冲洗，待干。

4．镜检计数 油镜下观察，凡中性粒细胞胞质内含有点状或斑块状深蓝色甲月替颗粒沉着者(只见一个典型颗粒也算)，即为NBT阳性细胞。计数100～200个中性粒细胞，算出NBT还原阳性细胞百分率。

【注意事项】

1．所用器材要清洁，避免玻璃表面因素增加NBT还原作用。

2．NBT试剂需用超细玻璃器过滤，不要残留颗粒；注意保存，不要被细菌污染。

3．孵育方式不同，会影响检出结果，在水浴内孵育的NBT还原阳性率会比在普通温箱中孵育者高。

4．涂片要推出头、体、尾，并厚薄适宜。太厚影响观察；太薄则细胞难找，计数费时。

5．单核细胞也可能还原NBT，应注意。聚集的或己破损的中性粒细胞，不可计数在内。

6．常有血小板粘附在中性粒细胞上，易与甲月替颗粒混淆，应仔细区别。

7．如无沙黄，也可用50g/L甲基绿染色15min代替；也可用瑞-吉染色，但切忌染液干涸在载玻片上。

【参考范围】 正常成人的NBT阳性细胞数在10%以下。若有10%以上中性粒细胞能还原NBT，即为NBT还原试验阳性；低于10%则为阴性。

【临床意义】 一般认为中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗骤增，己糖磷酸旁路代谢活性增强，还原NBT形成甲月替的能力也随之增强。故此试验可用于定性检测中性粒细胞产生O¯2的能力，以间接判断中性粒细胞的杀菌能力。

1．用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的筛选和辅助诊断 NBT还原试验阴性见于儿童慢性肉芽肿(CGD)、G-6-PD缺乏症、家族性X染色体连锁致死性肉芽肿（FFG）、髓过氧化物酶缺乏症和Job氏综合征（高IgE、IgA）时。如在涂片中能查出几个出现甲月替沉淀的中性粒细胞即可排除CGD。如在涂片中未查出有甲沉月替淀的中性粒细胞，即为可疑CGD时，可作细菌内毒素激发试验确诊之。方法如下：将1g大肠杆菌内毒素溶于5ml生理盐水，取0.05ml与0.5ml肝素抗凝血(12.5U肝素/m1血)在试管内混匀，盖住管口置室温15min后，按前述方法进行NBT还原试验．若NBT还原阳性细胞超过29%，即可否定CGD；若仍在l0%以下，即可诊断为中性粒细胞吞噬杀菌功能异常。

2．鉴别细菌感染和病毒感染 细菌感染时，中性粒细胞数量增多，粒细胞糖分解代谢活性增强，因此，全身性细菌感染时，患者的NBT还原阳性细胞通常在10%以上，而病毒感染或其他原因发热的患者则在10%以下。但若细菌感染而无内毒素等激发白细胞还原NBT的物质入血时，也可在10%以下。而病毒感染时常不增加或相对降低。

3．器官移植后发热的鉴别 器官移植后发热，若非细菌感染所致，其NBT还原试验阴性；若该试验阳性，则提示可能有细菌感染。

4．无丙种球蛋白血症、镰状细胞病、恶性营养不良、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病等，以及应用激素、细胞毒药物、保泰松等治疗时，NBT还原阳性细胞比例可降低。

5．新生儿、小儿成骨不全症、心肌梗死急性期，淋巴肉瘤，变应性血管炎、脓疮性银屑病、皮肌炎、某些寄生虫感染(如疟疾)、全身性真菌感染(如白色念珠菌性败血症)、注射伤寒菌苗后、口服避孕药或孕酮后，NBT还原阳性细胞比例可增高。

五、白细胞趋化试验

【目的】 掌握白细胞趋化试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】 白细胞趋化试验（white blood cell chemotaxis test），是在趋化室微孔滤膜的一侧放入粒细胞，另一侧放入趋化因子（细菌毒素、补体C3a、小淋巴因子等），检测离体粒细胞潜过滤膜到达趋化因子这一侧定向移动的能力。

【材料】

1．器材

（1）趋化室：用有机玻璃自制，分上、下两室，上室直径5.5mm，下室直径5.5mm，深8mm的圆形孔室，有两条直径4.5mm的孔道与外界相通。趋化室上室用于放置白细胞悬液，下室置趋化因子，中间隔以合适的滤膜。

（2）滤膜：直径13mm，孔径3μm、5μm、8μm，厚150μm，混合纤维素酯滤膜。

（3）离心管、滴管、载玻片、显微镜等。

2．试剂

（1）趋化因子：健康人(或豚鼠)新鲜血清3～4份混合，分装后-20～-40℃冻存24h(可用大肠杆菌培养液、酵母多糖活化血清、淋巴细胞衍生趋化因子等)。

（2）白细胞悬液：在10ml离心管中依次加入下述A、B、C、D四种浓度梯度液各2ml： ① A液：90.0g/L Ficoll 15.0ml加500.0g/L Hypague 10ml，相对密度1.14； ② B液：90.0g/L Ficoll 17.5ml加500.0g/L Hypague 10ml，相对密度1.13；③ C液: 90.0g/L Ficoll 20.0ml加500.0g/L Hypague 10ml, 相对密度1.12；④ D液：90.g/L Ficoll 24.0ml加339.0g/L Hypague 10ml，相对密度1.08。在D液上层加入用生理盐水1∶2稀释的受检者肝素抗凝血(10U/ml)2ml，1000r/min离心40min，在血浆与D液界面为单个核细胞，C、B界面为中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，B、A界面为嗜酸性粒细胞。

（3）甲醇、苏木素染液、乙醇等。

【方法步骤】（膜滤法）

1．将趋化因子0.5m1(用培养基作阴性对照)自外侧孔注入趋化室下室，封闭孔道，上室加入白细胞悬液0.3ml，37℃培养2h。

2．取出滤膜，甲醇固定后，在苏木素染液中染色15min，用蒸馏水冲洗。乙醇脱色。

3．再依次在70%、90%、100%的乙醇(或异丙醇)中脱水，每种浓度中各脱水3～5min。

4．将滤膜贴于载玻片上，封片。

5．镜检计数 油镜下观察滤膜。原来向上的一面为淋巴细胞与单核细胞，原来向下的一面只含移动过来的中性粒细胞(用孔径3μm的滤膜)，观察时应调节镜头焦距，计算5个高倍视野中中性粒细胞数(约250个)。阴性对照观察20~30个视野。通常以双份滤膜内移动细胞的平均数为趋化单位。

【注意事项】

1．测定白细胞趋化功能时，应作预实验以选择最适白细胞浓度、最适趋化因子浓度。

2．注意固定采用一种计数方法，即滤膜下表面计数法或滤膜内计数法。

3．滤膜的质量、厚度、孔的大小都能对趋化功能产生较大的影响，因此应使用统一滤膜。

4．各实验室应建立自己方法的参考范围。

【参考范围】 趋化指数3.0～3.5。

【临床意义】 趋化性是粒细胞在趋化因子的作用下到达炎症局部所必需的功能。趋化因子的量增多，细胞趋化移动加快。

1．趋化指数增高 主要见于细菌感染，其趋化指数常迅速增高。病毒感染，尤其是感染的早期，趋化指数常在正常范围内，故该试验在鉴别不明原因的感染中有参考价值。

2．趋化功能减低 主要见于：迟钝白细胞综合征（lazy-leukocyte syndrome）、Wiskot-Aldrich综合征、幼年型牙周炎、糖尿病、尿毒症、烧伤、新生儿、慢性皮肤粘膜白色念珠菌病、高IgE综合征、先天性鱼鳞病、膜糖蛋白(相对分子量ll kDa)缺陷症、肌动蛋白功能不全症、Chediak-Higashi综合征。当趋化因子生成不足或其抑制因子过多时也可出现趋化功能异常。

六、吞噬细胞吞噬功能试验

【目的】 掌握吞噬细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。

【实验原理】 吞噬细胞吞噬功能试验（phagocyte phagocytic function test ），是检测吞噬细胞吞噬功能的方法之一。活体巨噬细胞、单核细胞在体内外均有很强的吞噬细菌、异物的功能。在体外将吞噬细胞与异体细胞或细菌混合孵育后，染色观测其吞噬异体细胞或细菌的数量，可了解其吞噬功能。利用中药斑蝥在人的前臂皮肤上发疱，造成非感染性炎症，诱使单核细胞游出血管大量聚集于疱液内，抽取疱液即为天然提纯的吞噬细胞悬液。以鸡红细胞（CRBC）为靶细胞，经体外37℃温育后，涂片染色，显微镜下观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬消化活性，并计算吞噬率和吞噬指数，以判断吞噬细胞的吞噬功能。

【材料】

1．器材 眼科镊子、长镊子、滤纸、盖玻片、37℃水浴箱、离心机、载玻片、显微镜等。

2．试剂

（1）10%的斑蝥酊剂：斑蝥10g，95%乙醇90ml，浸泡2周以上。

（2）5%鸡红细胞悬液。

（3）Aisever保存液：取葡萄糖2g、枸橼酸钠0.8 g、枸橼酸0.055g、氯化钠0.42g，加入蒸馏水100ml。配成后68.95kPa，10min消毒。

（4）生理盐水。

（5）吉姆萨染液。

（6）甲醇等。

【方法步骤】

1．制备皮疱液

（1）先用眼科镊子取lcm2大小的滤纸2张，蘸上10%斑蝥乙醇浸出液，贴敷在前臂屈侧皮肤上，在滤纸下压一块血细胞计数板盖玻片，上面再敷以消毒纱布，用橡皮膏固定之。

（2）4～5h后，将滤纸、盖玻片和纱布一并取下换上一个拱形塑料盖，以防止开始形成的水疱破裂。

（3）48h后，在前臂皮肤上可形成一个同盖玻片一样大小的水疱，用无菌注射器或三棱针小心将皮疱液全部挤出。最后，局部涂以消炎药膏，以无菌纱布敷盖。

2．制备5%鸡红细胞（CRBC）悬液

（1）自鸡的一侧翅翼下静脉取血，将鸡血加到置有Alsever液的消毒青霉素瓶中，充分混匀。血与Alsever液的比例为1∶5。放4℃冰箱可保存半个月。

（2）临用前用生理盐水洗涤鸡红细胞3次，头2次离心为1500r/min离心3min，第3次2000r/min离心5min，按红细胞压积用生理盐水配成5%的鸡红细胞悬液。

3．吞噬细胞吞噬功能检测

（1）斑蝥刺激皮疱液lml，加5%的鸡红细胞悬液0.04ml，置硅化离心管中混匀，置37℃温育30min，每10min轻轻摇动一次。

（2）1000r/min离心l0min，弃上清。

（3）取沉淀细胞涂片，干后用甲醇固定，吉姆萨染色(吉姆萨染液用缓冲液作1∶4稀释)。

（4）镜检计数：油镜下观察吞噬细胞吞噬消化鸡红细胞的情况，并至少计数200个吞噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率（%）= ×100%

吞噬指数=
【注意事项】

1．斑蝥浸液对皮肤有刺激作用，其用量应适当、恒定。用量过多，反应过强，48h后皮疱液内中性粒细胞较多，使用适当，才可获大量的巨噬细胞。

2．取皮疱液时，应严格无菌操作，并尽可能吸净皮疱液，如不易抽出，可从不同角度抽吸，因残留的皮疱液易导致继发感染。

3．若皮疱液中蛋白过高，易凝固，可在试管内加入适量抗凝剂。

4．皮疱液不能立即检查时，可置4℃冰箱放置2～4h，对巨噬细胞形态和功能无影响。

5．最好设正常对照，便于判断结果的可靠性。

6．必须掌握好吞噬作用时间，时间过长被吞噬的鸡红细胞可被消化，时间过短则未被吞噬。

7．涂片的厚薄应适宜，太厚影响观察；太薄则细胞难找，计数费时。

8．通常应计数200~500个细胞。计数少，影响结果的可靠性。

【参考范围】 吞噬率： 61.39～64.15%；吞噬指数：1.009～1.107。

【临床意义】 吞噬细胞是机体单核吞噬系统的重要组成部分，其在组织中含量多，分布广，移动力强且能识别肿瘤细胞，在机体免疫监视系统中发挥主要作用。本试验可测定吞噬细胞的非特异性吞噬功能，在吞噬细胞功能检测的基础理论研究和临床治疗方面都有重要意义。

1．巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于各种恶性肿瘤，如食道癌、胃癌、肠癌、宫颈癌等，其吞噬率常低于45%，肿瘤消除后可以上升，故可作为肿瘤病人手术、化疗、放疗及免疫治疗疗效观察的参考指标。

2．一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作为预测感染发生的概率、观察疗效及判断预后的指标。

第二节 白细胞代谢及其产物检验

一、末端脱氧核苷酰转移酶检测

【目的】 掌握末端脱氧核苷酰转移酶检测的原理、方法、注意事项和临床意义。

（一）酶免疫组织化学检测

【实验原理】 酶免疫组织化学检测（enzyme immunohistochemistry assay）是利用一种DNA聚合酶，即末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)，直接催化细胞的脱氧核苷酸，使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3-OH端，合成单链DNA。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应，可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术，用辣根过氧化物酶-抗酶复合物在细胞涂片上定位，显示细胞内的TdT。

【材料】

1．器材 离心管、载玻片、微量移液器、滴管、37℃水浴箱、离心机、显微镜等。

2．试剂

（1）淋巴细胞分离液（相对比密为1.077）。

（2）过氧化氢-甲醇固定液：甲醇液中含H2O2浓度为0.03%(V/V)，4℃冰箱保存。

（3）0.1mol/L磷酸盐缓冲掖(pH7.2)。

（4）正常兔血清lgG。

（5）兔抗牛TdT抗体（作1:8稀释）。

（6）羊抗兔IgG（作1:10稀释）。

（7）PAP免疫复合物（作1:20稀释）。

（8）二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)溶液：0.05mol/L Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)l00ml，含过氧化氢(V/V)0.03%，4℃冰箱保存，用前加入30mg DAB，溶解后过滤，立即避光使用。

【方法步骤】

1．用淋巴细胞分离液分离新鲜抗凝血，取淋巴细胞层细胞离心涂片或直接涂片、待干。

2．将涂片用过氧化氢-甲醇液于4℃固定20~30min。

3．将涂片置0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡15min。

4．滴加兔抗牛TdT抗体，置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L PBS冲洗2次。

5．滴加羊抗兔lgG抗体，置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L PBS冲洗2次。

6．滴加PAP免疫复合物，置37℃湿盒内温育30min。用0.lmol/L PBS冲洗2次。

7．加入DAB溶液显色，室温避光作用5～10min。水洗5min，干后镜检。也可用哈氏苏木素液复染胞核10min后再行镜检。

【注意事项】

1．标本必须新鲜，以保证待测抗原活性。

2．抗体、PAP复合物和封闭血液不可反复冻融，应放4℃保存。

3．一抗、二抗和PAP复合物的温育必须在湿盒内进行。加抗体和PAP复合物加样量应以足以盖过血膜为宜。在温育过程中切忌液体干涸和分布不均匀。

4．去除内源性过氧化物酶所用的H2O2浓度宜为3%～4%，浓度过高会影响细胞抗原和细胞形态的完整性。

5．若用几种抗体同时检测不同的抗原，在第一抗体温育和漂洗过程中，要避免交叉污染。

6．双PAP法的重复标记可提高对微弱抗原的检出率，但以重复2次为宜，否则会增加非特异性着色和背景污染。

【判断结果】 阳性反应为棕黄色颗粒，定位在细胞核上。TdT为早期T淋巴细胞的标志，在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应。

【临床意义】 95%以上ALL和大约30%慢粒急淋变患者外周血细胞呈阳性反应，病情缓解后阳性率逐渐减弱。在ALL中，由于细胞表面标志不同，TdT活性也有变化，T-ALL，non-T-ALL，non-B-ALL细胞的阳性率很高。B-ALL细胞阴性。当外周血中此酶活性升高，预示血细胞的恶性变。因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗监测有一定意义。

（二）放射性同位素检测

【实验原理】 以3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等的dXTP为基质，用低聚脱氧核苷(dA)等人工同聚物作为引物，由于酶反应与引物重合，使基质不溶于三氯醋酸，可用玻璃纤维盘将其吸附，从未被放射性同位素标记的反应基质中分离出反应的生成物，并测定其放射活性。扣除不加引物所测定的内源性反应所引起的放射活性之后，可测算酶的活性。

【材料】

1．器材 试管、微量移液器、超速离心机、超声波细胞破碎机、液体闪烁

计数器等。

2．试剂

（1）淋巴细胞分离液（相对比密为1.077）。

（2）3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等。

（3）脱氧腺苷三磷酸。

（4）多聚脱氧腺苷或低聚脱氧核苷(dA)。

（5）二硫苏糖醇(DTT)。

（6）苯甲基磺酰氟化物(PMSF)。

（7）TritonX-HCl（pH7.5）。

（8）Whatman GF/C玻璃纤维盘。

（9）吡咯啉酸。

（10）乙醇。

（11）乙醚。

（12）甲苯系列闪烁液。

（13）蔗糖-TKM缓冲液：250mmol/L蔗糖，50mmol/L三氯醋酸(TCA)pH7.4，25mmol/L氯化钾，5mmol/L氯化镁，5mmol/L DTT，lmmol/L PMSF，5ml/L TritonX-100。

【方法步骤】

1．用蔗糖-TKM缓冲液提取末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，用d（PA）12～18测定TdT活性。

（1）提取粗酶液：在蔗糖-TKM中，加入经淋巴细胞分离液分离的白血病细胞(末梢血或骨髓血)，使成1×1011个细胞/L的悬液，放在干冰-丙酮中，使之急剧冻融5次，将细胞破坏，或用安装有微尖型探针的超声波细胞破碎机，使细胞破坏后，在冰浴中振荡15min，提取TdT，超速离心(70000r/min，60min)。取上清液作为粗酶液。

（2）测定TdT活性：取粗酶液50μl与测定TdT的基质液[50mmoI/L Tris-HCl pH7.5，30mmol/L氯化钾，0.5mmol/L DTT，5mmol/L dGTP (含有poly DT 0.05U，3H-dGTP37kBq)各50μl]混合，37℃温育20min后，置冰浴中使反应停止。将一部分涂在 Whatman GF/C玻璃纤维盘上。立即将此盘放入冰冷的60mmoI/L TCA+0.05mol/L吡咯啉酸液中，振荡15min，洗盘，再用30mmol/L TCA+0.025mol/L吡咯啉酸，冲洗2次，分别用乙醇及乙醚洗净，使盘干燥。把干燥的盘放入液体闪烁计数器用的小玻瓶中，加甲苯系列的闪烁液，使吸附在玻璃纤维盘上的反应生成物具有放射活性，再用液体闪烁计数器测定[通常以mmol dGTP掺入1×108个细胞来表示TdT活性，或用U/1×108细胞表示(1U等于60min内有lnmol的dGTP)]。

2．用0.25mol/L磷酸钾(pH7.5)提取TdT，用d（PA）40~60测定TdT活性，用含 lmmol/L 2-巯基乙醇(2-ME)的0.25mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)，在缓冲液中细胞以1×1011/L左右的浓度悬浮，用超声波破坏细胞(4次/15秒)，将其超速离心(70000r/min，60min)，所得上清液即是测定TdT活性的粗酶液。

【注意事项】

1．当测定ALL的幼稚细胞等有极高活性的标本时，即使使用粗酶液也能满意地检出其活性。当测定TdT活性低的标本时，由于在粗酶液中包含有蛋白酶，可能对TdT产生影响。此外，核酸酶的引物、反应生成物及某些抑制物及内源性引物等，均可能影响检测结果。用磷酸纤维素柱及蔗糖密度梯度离心沉淀法沉淀，用部分酶提纯进行测定时，可使这些问题在某种程度上得到解决。

2．为了从细胞中充分提取Td