SN∕T 4708-2016 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿犲 狋 犺 狅 犱狅 犳狏 犻 犫 狉 犻 狅犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲犪 狀 犱狏 犻 犫 狉 犻 狅犿 犻 犿 犻 犮 狌 狊犫 狔犱 狌 狆 犾 犲 狓狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犘犆犚犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩辉、杨宇、吴海磊、谭克为、宋亚京、李海山、徐宝梁。犛犖犜 国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚检测方法范围本标准规定了国境口岸霍乱弧菌和拟态弧菌的检测方法，包括检测对象、样本采集和处理、操作方法及结果报告。本标准适用于国境口岸入出境人员、环境水体携带霍乱弧菌（包括群、 群和非群 群霍乱弧菌）和拟态弧菌的分子生物学检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部令第 号）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 霍乱弧菌犞 犻 犫 狉 犻 狅犆犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲弧菌属，革兰氏染色阴性。病人和带菌者是霍乱的主要传染源，病人及带菌者的粪便或排泄物污染水源或食物后可引起霍乱暴发流行。霍乱有耐热的抗原和不耐热的抗原。根据抗原不同，霍乱弧菌可分为 多个血清型，其中仅群和 群霍乱弧菌产毒株可引起霍乱的流行。 拟态弧菌犞 犻 犫 狉 犻 狅犕犻 犿 犻 犮 狌 狊弧菌属，革兰氏染色阴性。广泛存在于自然界河水、海水和海产品中。是一种人和水产动物共患病病原菌，可以通过水体和水产品感染人类，已经成为某些地区散发性和流行性腹泻及食物中毒的病原菌之一。拟态弧菌生化特性与霍乱弧菌极为相似，主要是引起人类急性腹泻。缩略语下列缩略语适用于本文件。：聚合酶链式反应：脱氧核糖核酸：焦碳酸二乙酪： 羧基荧光素，一种荧光报告基团：六氯 甲基荧光素，一种荧光报告基团犛犖犜 ：黑洞淬灭基团检测对象 疑似感染霍乱弧菌和拟态弧菌的入出境人员的生物样本，如粪便、呕吐物等。 疑似污染霍乱弧菌和拟态弧菌的环境样本，如入境船舶压舱水等。生物安全要求 检测工作中的个人防护应按照 的要求进行个人防护。 实验室应遵循 和 对生物安全级（ ）实验室的生物安全要求。 使用过的实验用品应遵照 对废弃物的处理要求进行无害化处理。 样本运输应按照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的相关规定。仪器和设备 荧光定量仪。 生物安全柜。 普通冰箱。 及以下超低温冰箱。 普通台式离心机。 高速冷冻离心机（转速可达 犵） 。 涡旋器。 微量可调移液器（ 、 、 ）及配套带滤芯吸头。试剂 生理盐水：蒸馏水和 配制浓度为 的生理盐水。 核酸提取试剂：细菌基因组提取试剂盒（公司）。 核酸抽提液（含 和 的混合液） 。 实时荧光试剂：用公司的 ）。）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 水。 实时荧光引物及探针，如下： 霍乱弧菌检测引物和探针：上游引物： 下游引物： 探针： 犛犖犜 拟态弧菌检测引物和探针：上游引物： 下游引物： 探针： 检测程序 样本的采集、运输及保存 粪便样本采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集，水样便采集。亦可用已湿润的直肠棉拭插入直肠内处并轻轻旋转，将有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管用耐低温油性记号笔记上编号，立即置于冷藏箱内，送到实验室，立即对粪便样本进行核酸提取。如不能在内检测应插入 运送培养基运送。 呕吐物样本用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放入灭菌塑料管、自封塑料袋或灭菌带盖瓶中，密封后用耐低温油性记号笔记上编号，立即置于冷藏箱内，送到实验室。 水样样本以灭菌的 盐水瓶采集水样 ，密闭后用耐低温油性记号笔记上编号，尽快运送到实验室。如不能在一天内送检者，应在采水点即将浓缩蛋白胨水加至水样中，即将 倍浓缩碱性蛋白胨水 加入 水样中，摇匀，室温运送至实验室。 样本的前处理 粪便样本挑取米粒大小粪便或水样便，放置于有 生理盐水的离心管中，振荡混匀， 犵离心 。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 呕吐物样本挑取指甲大小呕吐物，放置于有 生理盐水的离心管中，振荡混匀， 犵离心 。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 水样本将采集的 水样本，将 倍浓缩碱性蛋白胨水加入 于 培养， 犵离心 。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 样本的核酸提取将采集的粪便样本、呕吐物样本可直接应用公司的成品试剂盒，依据说明书提取样本核酸，可直接用于荧光反应。将采集的 水样本，加入 十倍浓缩碱性蛋白胨水于 培养， 犵离心 。去尽上清，沉淀用公司的成品试剂盒，依据说明书提取样本核酸，可直接用于荧光反应。犛犖犜 注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同提取试剂盒。 荧光犘犆犚检测 霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚反应体系霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光反应体系，按表顺序依次加入。表霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚反应体系（以 犔体系为例）名称浓度加样量模板上游引物 下游引物 探针 上游引物 下游引物 探针 水 霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光犘犆犚反应程序反应管置于荧光定量仪上，推荐循环参数设置： ， ； ， ，循环 次；在退火阶段检测荧光。反应体系为 。注：程序设置是以 型全自动荧光定量检测仪为例说明，将荧光信号设置为： ：， ：。其他型号的实时荧光仪，可参考上述程序作适当调整。 结果判定及报告 基线和对照根据使用不同的荧光定量仪设定好基线，设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，也可根据仪器噪声情况调整。阳性对照可为霍乱弧菌和拟态弧菌核酸，也可为根据霍乱弧菌和拟态弧菌核苷酸序列体外合成的片段，阴性对照为不含霍乱弧菌和拟态弧菌核酸的样本。 荧光犘犆犚反应的质量控制实验检测的结果应同时符合以下个条件，否则试验结果无效：）阴性对照无扩增曲线；）阳性对照犆 狋值 并有明显扩增曲线。 荧光犘犆犚检测结果判定及报告实验检测的结果判定如下：）阴性：无犆 狋值或犆 狋值 ，且无明显扩增曲线，报告为霍乱弧菌或拟态弧菌双重荧光检犛犖犜 测阴性；）阳性：犆 狋值 ，并有明显扩增曲线，报告为霍乱弧菌或拟态弧菌双重荧光检测阳性；）疑似：犆 狋值在 之间。疑似样本应重做，若重做结果仍为典型扩增曲线，则报告为霍乱弧菌或拟态弧菌双重荧光检测阳性。 检测结果的解释实验室环境污染、试剂污染或样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，会出现假阴性或定量检测不准确的结果。当检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限 时可能会发生假阴性的结果。犛犖犜