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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 79 mRNA 在早期酒精性脂肪性肝病中的差异表达分析 李毅勤 西南医科大学附属中医医院检验科，四川 泸州 646000 摘要：摘要：目的 目前对于早期酒精性脂肪性肝病（ALD）的病理生理机制仍不完全清楚，包括 mRNA 对其的调控机制。本研究通过微阵列分析比较了 ALD 肝脏与正常肝脏的差异表达基因，以进一步了解 ALD 的发病机制。方法 采用Lieber-DeCarli 酒精液体饲料喂养小鼠 6 周，建立小鼠早期 ALD 肝脏模型。运用 HE 及油红染色观察小鼠肝组织的病理形态及脂肪变性。随后在两组中分别随机选择 3 个肝组织样本，应用微阵列分析检测两组肝组织中 mRNA的差异表达。结果 HE 染色及油红染色显示实验组肝脏出现脂肪样变性及轻微炎性病变，早期 ALD 模型构建成功。微阵列分析共筛选出 432 个差异表达的 mRNA，其中 208 个 mRNA 表现为上调，215 个 mRNA 表现为下调。结论 在ALD 的早期阶段，酒精暴露改变了一系列 mRNA 的表达。这些差异 mRNA 的共同调控可能与早期 ALD 的发生发展密切相关，这可能为 ALD 提供新的生物标志物。关键词：关键词：酒精性脂肪肝；mRNA；微阵列分析 中图分类号：中图分类号：R575 酒精性脂肪性肝病（ALD）是一种由于过度饮酒和长期饮酒引起的肝脏损害，其临床组织学特征包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌1。大多数患者在 ALD 的早期无症状，通常仅有单纯性脂肪变性或脂肪肝，炎症程度低。而当发现症状时往往已诊断为晚期，预后较差，治疗选择有限。因此，如果能在 ALD 早期采取积极的预防措施，有望预防甚至逆转 ALD2。因此，了解早期疾病的分子机制和开发预防疾病进一步发展的治疗方法是很重要的。miRNA 是一类小的、进化上保守的内源性非编码RNA，长度为 18-24 个核苷酸，在转录后调节基因表达3。mRNA则是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息，能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸4。研究表明，miRNA 在不同的疾病过程中主要通过靶向调控 mRNA 关键基因来发挥重要作用。因此 mRNA的差异表达可以直接影响疾病的进程变化。例如，ALD患者肝脏中 HIF1 水平会出现一个下调，从而来护肝脏免受乙醇诱导的损伤5。肝脏中的关键基因 ZEB2 可以调控 ALD 中肝细胞的凋亡，其可作为 ALD 新的治疗靶点6。又例如酒精可以通过降低 ALD 肝脏中 LAMP1 和LAMP2 来破坏自噬功能，从而破坏细胞稳态7。mRNA 可以作为新的生物标志物用于心血管疾病、自身免疫性疾病和癌症等多种疾病的诊断和治疗监测，是肝脏疾病的新型生物标志物8,9。然而，这些研究仅揭示了某些 mRNA 介导的 ALD 的部分复杂机制。在这些大量的潜在因素中，很难研究哪些 mRNA 在 ALD 的发病机制中起重要作用，特别是在ALD 的早期。随着新一代基因检测技术的快速发展，高通量微阵列芯片成为最常用的深度检测转录组的分析工具。微阵列及其靶基因的功能分析是识别在病理过程中起重要作用的 mRNA 的好方法。因此本研究采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养C57BL/6j小鼠6周建立早期 ALD 模型，采用 mRNAs 基因芯片技术筛选出ALD 早期肝组织中所有的差异表达的 mRNA，以便后期进一步了解 mRNA 介导 ALD 可能的生物学途径及分子机制。1 材料与方法 1.1 动物及实验方法 选取 6-8 周龄 C57BL/6 雄性小鼠(购自北京斯贝福生物技术有限公司)，随机分为实验(n=12)和对照组(n=12)，饲养于西南医科大学恒温动物房（221），光照周期为 12 h/黑暗周期为 12 h。两组小鼠采用等热量喂养法喂养，其中实验组小鼠喂养采用 Lieber-DeCarli 酒精液体饮食。这是一种酒精肝固定诱导模型，可诱导有限的炎症反应和肝损伤10。实验组适应性喂养 3 天后，开始逐渐加入酒精喂养，其中酒精含量由最开始 9%逐渐增加到 14%和 19%（不同酒精含量各喂养2 天），直到小鼠摄入含有 28%乙醇的饮食，然后再持中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 80 续喂养 5 周随后禁食 12 小时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，随后从全血中分离血清，并立即储存肝脏。对照组采用不含酒精的液体饮食喂养相同时间后以同样的方式处死小鼠，收集肝脏。组织病理学分析用 10%(vol/vol)福尔马林固定肝组织，石蜡包埋，然后进行H&E 或油红 O 染色。所有实验均经西南医科大学伦理委员会批准。1.2 生化指标检测 采用 Mindray BS2000M 全自动生化分析仪检测小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和总胆汁酸(TBA)。1.3 RNA 提取 根据制造商的说明，使用 TRIpure Reagent(ELK Biotechnology,Ep013)从肝组织中分离总 RNA。使用NanoDrop 2000分 光 光 度 计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)检测 RNA 纯度，并用凝胶电泳评估完整性。1.4 芯片分析 我们从对照组和实验组中分别随机选择 3 个肝脏样 本，使 用 微 阵 列 芯 片(Affymetrix GeneChip mRNA4.0;Affymetrix,Santa Clara,CA,USA;)进行mRNA 基因表达谱检测。利用 GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)对杂交信号进行。使用 Affymetrix Expression Console 软件 1.3 对原始数据进行提取、预处理、去除背景信号和中位数归一化。使用Affymetrix 转录组分析控制台(TAC)鉴定差异表达的mirna,p1。1.5 数据统计分析 使用 SPSS20.0 统计软件处理实验数据，所有实验数据用均值标准差（x s）表示。如果实验数据服从正态分布且方差齐，则用独立样本 t 检验进行统计学分析。如果实验数据不服从正态分布，则使用Mann-Whitney U 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 2.1 成功建立小鼠模型 如图 1b 所示，H&E 染色显示，对照组肝细胞无明显病变，细胞核结构清晰。实验组肝细胞气球样脂肪变性，肝小叶结构轻度紊乱，小叶及门静脉区混合炎性细胞浸润。同时，油红 O 染色显示，与对照组相比，实验组肝细胞内有大量红染的脂滴。接下来，我们检查了两组的肝脏指数和血清中的酶水平。发现乙醇喂养小鼠的肝脏指数显著升高(图 1c)。与对照组相比，实验组ALT水平高表达(图1d)，差异有统计学意义(P0.05)。然而，两组 TG 没有明显变化(图 1d，图 1e)。这些数据与葛晓东的实验结果一致11。结果表明，早期酒精性肝损伤模型已成功建立。再检测两组间 AST、TC、TBA水平，差异无统计学意义。这说明在 ALD 早期，ALT 水平首先升高，而其他指标变化不明显。图 1 Lieber-Decarli 饮食诱导小鼠酒精性脂肪肝的形成(a)实验组（EtOH）酒精饮食和对照组(Ctrl)饮食方案表，两组小鼠在适应饲养 3 天后，分别饲喂等热量饲料(control)或 Lieber-DeCarli 饲料，持续 6 周。(b)小鼠肝脏切片 H&E 染色和油红 O 染色(标尺=200m)。(c)乙醇饲喂后肝脏指数(小鼠肝重/体重之比)。(d,e)血清谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。(f-h)血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)水平。数据为平x s。*:P0.05，*:P0.01,ns:无统计学意义。2.2 酒精性脂肪肝 mRNA 差异性表达。为了研究早期酒精性脂肪肝中 mRNA 的表达谱，我们对乙醇喂养的 ALD 肝组织进行了 mRNA 微阵列分析，并将其与对照组肝脏的 mRNA 微阵列进行了比较。共筛选出 432 个差异表达的 mRNA，其中 208 个 mRNA 表现为上调，包括 Jun、Glb1l2、Frzb、Glb1l2 及 Ctla2b等基因，215 个 mRNA 表现为下调，包括 S100a9、Chdh、Ighm、Camp 及 Ngp 等基因。表 1 列出了最显著差异表达 mRNA 的详细信息。对所有差异 mRNA 构建热图如图中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 81 2 所示，其中红色表示表达上调的基因，绿色表示表达下调的基因。表 1 对照组和实验组 mRNA 表达谱中最显著上调和下调的前 10 个 mRNA 基因 ID 基因名 Fold Change 值 q 值 显著上调的前 10 个 mRNA 1417409 Jun 14.82 0.03 1433727 Glb1l2 14.28 0.001 1416658 Frzb 13.87 0.03 1426936 Gm6958 13.48 0.001 1433728 Glb1l2 13.23 0.001 1452352 Ctla2b 12.56 0.001 1424857 Trim34a 11.24 0.001 1419598 Ms4a6d 10.67 0.005 1424133 Tmem98 10.26 0.001 1427040 Mdfic 10.04 0.001 显著下调的前 10 个 mRNA 1448756 S100a9 0.0979 0.01 1455435 Chdh 0.0966 0.02 1427351 Ighm 0.0917 0.02 1419691 Camp 0.0867 0.03 1418722 Ngp 0.0762 0.02 1434857 Zfp783 0.0661 0.001 1442339 Stfa2l1 0.0654 0.01 1427329 Ighm 0.058 0.02 1431213 Gm3579 0.0304 0.001 1422011 Xlr 0.0293 0.001 图 2 差异表达基因热图，其中红色表示上调基因，绿色表示下调基因，S 表示酒精性脂肪肝组织，D 表示正常肝组织（数字表示随机选择的肝组织编号）3 讨论 酒精性脂肪性肝病（ALD）是常见的慢性肝病的一种，其中饮酒量的多少与 ALD 发生发展的风险呈剂量反应关系12。ALD 的发病机制可能与肝细胞损伤、炎症细胞活化、肠通透性变化及菌群改变等密切相关13。目前很多关于 ALD 疾病发生的分子机制仍不清楚，需要进一步研究。因此，我们首先建立了一个模拟人类的饮酒方式及酒精诱发肝脏病理改变的小鼠模型，我们采用Lieber-Decarli 饮食法建立早期 ALD 模型，研究早期酒精性肝损伤小鼠肝脏 mRNA 谱，以期找到 ALD 疾病进展中可能相关的新机制和治疗靶标。为转向临床研究提供前期研究基础。在本实验中，造模后对肝指数的测定以及 HE 染色及油红染色均证明了实验组肝细胞出现了脂肪变性。ALT 和 AST 是用于评价肝功能最常用的指标，对小鼠血清学检测生化指标提示实验组ALT较对照组明显升高，而 AST 及 TBA 未见明显改变，表明造模的肝脏损伤较轻微，也进一步说明 ALT 是早期酒精性脂肪性肝病较早出现变化的指标。这些均表明我们的早期 ALD 模型构建成功。越来越多的证据表明，酒精的影响可以导致ALD肝脏中 mRNA 表达谱异常。然而，关于早期 ALD 肝脏 mRNA表达谱的研究较少。因此我们进一步对构建成功的早期 ALD 肝脏模型进行微阵列分析，得到了 432 个差异表达的 mRNA，这些 mRNA 可能是介导早期 ALD 的关键基因。例如已有研究证实 Toll 样受体 4(TLR4)的高表达可以促进氧化应激和细胞凋亡，TLR4 在非酒精性脂肪性肝炎中出现过表达，从而增加促炎细胞因子的产生，加重炎症发生14,15。TLR4 是脂多糖（LPS）介导的跨膜信号传导的重要受体，在慢性乙醇中毒过程中，乙醇可以诱导患者血液中 LPS 水平升高。循环 LPS 穿过肠道屏障转运到肝脏，从而激活肝细胞和巨噬细胞上的 TLR4，促进炎症的发生发展16,17。这可能是 TLR4 介导 ALD 发病机制之一。在我们实验中也发现 TLR4 在小鼠早期 ALD 肝脏中呈高表达，进一步说明 TLR4 可能是调控 ALD 的关键基因之一。总之我们筛选出了早期 ALD 的 mRNA 差异表达谱，提示差异表达的 mRNA 可能参与调控 ALD 的发病过程。并为后续研究 mRNA 功能和作用机制指明了方向。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 82 参考文献 1Barve A.,Marsano L.S.,Parajuli D.,et al.Alcoholic Liver DiseaseM.Journal,2017,(Issue):2Su Q.,Tian Y.,Liu Z.,et al.Purinergic P2X7 receptor blockade mitigates alcohol-induced steatohepatitis and intestinal injury by regulating MEK1/2-ERK1/2 signaling and egr-1 activityJ.International Immunopharmacology,2019,66:52-61.3Xu T.,Li L.,Hu H.,et al.MicroRNAs in alcoholic liver disease:Recent advances and future applicationsJ.Journal of Cellular Physiology,2019,234(1):382-394.4LIU A,WANG X.The Pivotal Role of Chemical Modifications in mRNA TherapeuticsJ.Frontiers in cell and developmental biology,2022,10(901510.5Satishchandran A.,Ambade A.,Rao 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