lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响.pdf

基 础 研 究Experimental Research中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen Surg682IncRNA SNHG1 靶向 miR-7 对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响韩国雄1仲守泰李才茂马敏星1苏宏？青海省第五人民医院1放疗二科2 乳腺科3胃肠科（青海西宁8 10 0 0 0）【摘要】目的：探讨IncRNASNHG1通过miR-7对结直肠癌(CRC)细胞放疗抵抗的影响。方法：将CRC细胞 HT29 分为 ctrl 组、si-NC 组、si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor-NC组、si-SNHG1+miR-7in-hibitor组，qRT-PCR检测细胞中SNHG1、m i R-7 的表达；克隆形成实验检测细胞放射敏感性；MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot 检测细胞中 PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3、G LU T 1、HK2 的表达;双荧光素酶报告基因实验验证 SNHG1 与 miR-7 的关系。结果：与 ctrl 组、si-NC 组比较,si-SNHG1组的 HT29 细胞的 PE、SF、A 4g o 值、PCNA、G LU T 1、H K 2 表达明显降低(P0.05),细胞凋亡率、Bax、Ca s p a s e-3表达明显上升（P0.05）；与si-SNHG1组、si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组 HT29 细胞的 PE、SF、A 4s o 值、PCNA、G LU T 1、H K 2 表达显著升高(P0.05）,细胞凋亡率、Bax、Ca s p a s e-3表达明显降低(P0.05);双荧光素酶报告显示,SNHG1靶向调控miR-7表达。结论：敲低 SNHG1可能通过靶向调控miR-7,进而改善 CRC的放疗抵抗。【关键词】SNHG1miR-7结直肠癌放疗抵抗克隆【中图分类号】R735.7【文献标识码】Adoi:10.3969/j.issn.1009-9905.2023.03【文章编号】10 0 9-990 5（2 0 2 3)0 9-0 6 8 2-0 6Influence of lncRNA SNHG1 on radioresistance of colorectalcancer cells by targeting miR-7HAN Guo-xiong,ZHONG Shou-tai,LI Cai-mao,MA Min-xing,SU HongDepartment of Second Radiotherapy,Department of Breast,Department of Gastroen-terology,the Fifth Peoples Hospital of Qinghai Province(Xining 810000,China)ABSTRACT Objective:To investigate the influence of long non-coding RNA small nucleolarRNA host gene 1(lncRNA SNHG1)on the radioresistance of colorectal cancer(CRC)cells via miR-7.Methods:CRC cells HT29 were separated into:ctrl group(normally cultured HT29 cells),si-NCgroup(transfected with si-NC),si-SNHG1 group(transfected with si-SNHG1),si-SNHG1+in-hibitor-NC Group(co-transfected with si-SNHG1 and inhibitor-NC),and si-SNHG1+miR-7 in-【作者简介】韩国雄（198 3-11），男，青海西宁人，主治医师，研究方向：放疗。E-mail：a h q l u o 16 3.c o m【通信作者马敏星（198 2-0 1）,男，青海西宁人，博士，主治医师,研究方向：肿瘤放射治疗学及肿瘤相关蛋白糖基化。E-mail:韩国雄，等.lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响hibitor group(co-transfected with si-SNHG1 and miR-7 inhibitor);qRT-PCR was applied to detectthe expression of SNHG1 and miR-7 in cells;clonogenic assays were applied to detect cellular ra-diosensitivity;MTT assay was applied to detect cell proliferation;flow cytometry was applied to de-tect apoptosis;Western blot was applied to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA),Bcl-2-associated X protein(Bax),cysteine protease 3(Caspase-3),glucose transporter 1(GLUT1),hexokinase 2(HK2);and dual-luciferase reporter assays were applied to verify the relation-ship between SNHG1 and miR-7.Results:Compared with ctrl group and si-NC group,the colonyformation rate(PE),survival fraction(SF),A4o value,PCNA,GLUT1,HK2 expression of HT29 cells insi-SNHG1 group were obviously decreased(P0.05),the apoptosis rate,and the Bax,Caspase-3expression were obviously increased(P0.05);compared with si-SNHG1 group and si-SNHG1+in-hibitor-NC group,the PE,SF,A4co value,PCNA,GLUT1,HK2 expression of HT29 cells insi-SNHG1+miR-7 inhibitor group were obviously increased(P0.05),the apoptosis rate,and the Baxand Caspase-3 expression were obviously decreased(P0.05);dual-luciferase reporter revealedthat SNHG1 targeted miR-7 expression.Conclusion:Knockdown of SNHG1 may improve the ra-dioresistance of CRC by targeting and regulating miR-7.KEY WORDS】SNH G 1.M i R-7.Co l o r e c t a l c a n c e r RadioresistanceClone683结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的其发病率和死亡率较高,严重威胁人们的生命健康安全 1-2 。目前治疗CRC主要依靠手术和放疗、化疗相结合的方法，但放疗抵抗常导致放疗失败,降低治疗效果 3-4。既往研究表明，长链非编码RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)在CRC 放疗抵抗中具有重要调控作用 5-6 。在CRC细胞中检测到lncRNA SNHG1过表达,其显著促进了CRC细胞的上皮-间充质转化 7 。本研究通过生物信息学发现,SNHG1与miR-7可靶向结合，miR-7过表达显著抑制CRC细胞体外恶性生物学行为 8 。因此,本研究主要探究SNHG1对CRC细胞放疗抵抗的影响以及其可能的分子机制。1材料和方法1.1主要材料和试剂人CRC细胞系HT29购自中科院上海细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；兔源一抗PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、GLUT1、H K 2 均购自美国Ab-cam公司;LipofectamineTM2000Reagent 购自美国Invitrogen公司;si-SNHG1及 si-NC、m i R-7 i n h i b i t o r及 inhibitor-NC、m iR-7 m im ic 及 mimic-NC,SNHG1及miR-7引物购自广州RiboBio公司。1.2细胞培养将HT29细胞置于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI1640培养基中，常规培养换液，收集对数期的细胞进行实验。1.3细胞转染及分组将对数期的HT29细胞分为ctrl组（正常培养的HT29细胞）、si-NC组（转染si-NC)、s i-SNH G 1组（转染 si-SNHG1)、s i-SNH G 1+inhibitor-NC 组（si-SNHG1 和inhibitor-NC 共转染）、si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组（si-SNHG1和miR-7inhibitor共转染）。1.4细胞照射条件采用医用高能直线加速器对细胞进行体外照射，应用6 MV的X射线，照射野20cmx20 cm,源皮距10 0 cm,以3Gy/min的固定剂量率发射。1.5?qRT-PCR法检测SNHG1、mi R-7 表达使用Trizol试剂提取各组细胞中的总RNA，将RNA逆转录为cDNA后，以cDNA为模板上RT-qPCR仪进行扩增。引物序列见表1。分别以GAPDH、U 6 为内参,采用2-AACT计算细胞中SNHG1、mi R-7 的相对表达量。表1基因引物序列引物名称序列（5-3）SNHG1正向反向miR-7正向反向GAPDH正向反向U6正向反向1.6克隆实验检测细胞放射敏感性取对数生长期的细胞接种于6 孔板中,每组分别给予细胞0、2、4、6、8 G y 的6 MVX射线照射，继续培养14d,甲醇固定，结晶紫染色，计数。克隆形成率（platingef-ficiency,PE)=克隆数/接种的细胞数10 0%，细胞存AGGCTGAAGTTACAGCTTTGGCTCCCTGTGTCTTTGGAAGACTAGTGATTTTGTTCCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTCCCTTCCGTGTCACTGCCTGCTTCACCACCTTCGCTCGCTTCGGCAGCACAGAGGTATTCGCAGAGGA中国现代普通外科进展2 0 2 3年9月第2 6 卷第9期活分数（survival fraction,SF）=PE实验组/PE对照组SNHG1+miR-7 inhibitor 组 HT29 细胞中 miR-7表100%,利用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF=1-达降低（P 1表示敏感性增强，1则表示敏感性降低。1.7MTT法检测细胞增殖取各组细胞,调整密度接种到96 孔板中,培养过夜。分别将细胞培养2 4、48、7 2 h 后，避光加入MTT溶液，孵育4h，再加人DMSO。使用酶标仪检测吸光度(absorbance,A)。1.8流式细胞仪检测细胞调亡取各组HT29细胞,PBS洗涤后添加10 0 L结合缓冲液悬浮，再分别添加AnnexinV-FITC和PI染液5L，于室温下避光染色15min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。1.9Westernblot检测蛋白表达取各组对数期细胞，RIPA裂解缓冲液提取照射48 h后的HT29细胞总蛋白。采用电泳分离蛋白，10 0 V恒压转移至PVDF膜上,脱脂牛奶封(5%)闭2 h,将膜与一抗PCNA、Ba x、Ca s p a s e-3、G LU T 1、H K 2、G A PD H,在4孵育过夜,再将膜与二抗室温下孵育2 h，弃去液体，加人ECL试剂观察蛋白质印迹，ImageJ软件评估蛋白的灰度值。1.10双荧光素酶报告基因实验构建SNHG1野生型质粒（SNHG1-WT）和突变型质粒（SNHG1-MUT)，将 SNHG1-WT和SNHG1-MUT分别与mimic-NC或miR-7mimic共转染于HT29细胞,48h后,检测荧光素酶活性。1.11统计学处理采用Graphpad Prism7.0软件。数据以x土s表示。单因素方差分析用于多组间的比较,进一步两组间的比较采用SNK-q检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1各组HT29细胞中SNHG1、mi R-7 表达比较与ctrl组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞中SNHG1表达降低、miR-7表达升高（P0.05）；与 si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-ab工工si-SNHG1+inhibitor-NC 组1.5si-SNHG1+miR-7inhibitor组工1.0ab0.5工0.0SNHG1图1各组HT29细胞中SNHG1、m i R-7 表达注：a：与ctrl组比较,P0.05;b：与si-NC组比较,P0.05;c：与si-SNHC1组比较,P0.05;d:与 si-SNHC1+inhibitor-NC组比较,P0.052.2各组HT29细胞放射敏感性情况比较在相同剂量照射条件下，与ctrl组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞SF、PE显著降低(P0.05);与si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor组细胞 SF、PE升高（P0.05)。见表2、图2 5。组别ctrl组si-NC组si-SNHG1组si-SNHGl+inhibitor-NC组si-SNHG1+miR-7inhibitor 组 1.6 38 0.48 7 1.346 0.42 8 0.6 11 0.7 54si-NC组150si-SNHG1组si-SNHG1+inhibitor-NC 组si-SNHG1+miR-7 inhibitor组cd100ab工）S500图2 各组HT29细胞放射敏感性的影响注：a：与ctrl组比较,P0.05;b：与si-NC组比较,P0.05;c：与si-SNHG1组比较,P0.05;d:与si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,P0.05cdmiR-7表2 单击多靶模型参数Do/Gy Dq/GyNSF2kSER2.5471.2351.624 0.617 0.3932.486 1.069 1.537 0.583 0.4021.257 0.161 1.137 0.192 0.796 1.6351.1630.2551.245 0.2140.8601.518ctrl组cdab.工TTOGy2Gycdab.4Gycdab6Gy8Gyabcdctrl组si-NC组图3各组HT29细胞克隆形成情况(6 Gy)si-SNHG1 组si-SNHG1+inhibitor-NC 组si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组韩国雄，等.lncRNA SNHG1靶向miR-7对结直肠癌细胞放疗抵抗的影响50厂2.0si-SNHGI组si-SNHG1+inhibitor-NC 组40si-SNHGl+miR-7inhibitor组cd工ab20工工100图4转染后对各组HT29细胞PE的影响注：a:与ctrl组比较,P0.05;b:与si-NC组比较，P0.05;c：与 si-SNHG1组比较,P0.05;d:与 si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,P0.052.3各组HT29细胞增殖能力比较与ctrl 组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞A490值降低(P0.05)；与 si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组 HT29 细胞 A490104101010100100si-SNHG1+inhibitor-NC 组1010元10210100100Annexin V-FITC2.5各组HT29细胞中相关蛋白表达比较组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞PCNA、CLUT1、H K 2 蛋白表达降低,Bax、Ca s p a s e-3表达升高(P0.05);与 si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组HT29细胞 PCNA、G LU T 1、H K 2 蛋白表达升高,Bax、Ca s-pase-3表达降低(P0.05)。见图 7。ctl 组si-NC组ctl 组101102Annexin V-FITC101102ctrl组si-NC组si-SNHG1组si-SNHG1+inhibitor-NC 组1.5si-SNHCI+miR-7inhibitor 组II值31.00.50.0L注：a：与ctrl组比较,P0.05;b：与si-NC组比较,P0.05;c：与si-SNHG1 组比较,P0.05;d:与 si-SNHG1+inhibitor-NC组比较,P0.05值升高(P0.05)。见图6。2.4各组HT29细胞凋亡情况比较与ctrl组、si-NC 组比较,si-SNHG1组HT29细胞凋亡率升高(P0.05)；与 si-SNHG1 组、si-SNHG1+inhibitor-NC 组比较,si-SNHG1+miR-7 inhibitor组HT29细胞凋亡率降低(P0.05),见图6。si-NC 组1010E1010100103104103104cd工cdcd工abab工T24h图5各组HT29细胞A4go值10+1010210110100101AnnexinV-FITCsi-SNHC1+miR-7 inhibitor 组104103102101100100图6各组HT29细胞凋亡情况比较与 ctrl2.6双荧光素酶报告基因检测结果利用Starbase网站预测SNHG1与miR-7的结合位点，见图8。与mimic-NC和SNHG1-WT共转染组比较,miR-7mimic和SNHG1-WT共转染组荧光素酶活性降低(P0.05),见表 3。3讨论CRC是消化道常见的恶性肿瘤之一,早期发病685ab工工48 h72 hsi-SNHG1组10210310102Annexin V-FITC1041031041010101010Annexin V-FITC中国现代普通外科进展2 0 2 3年9月第2 6 卷第9期抗密切相关 16 。本研究结果显示，敲低SNHG1可降低HT29细胞的增殖和有氧糖酵解能力，促进细胞PCNA调亡，提示SNHG1促进CRC发展。克隆形成实验是放射增敏研究的主要方法之一，本研究结果显示，686BaxCaspase-3GLUT1HK2GAPDH图7 westernblot检测HT29细胞中PCNA、Ba x、Caspase-3、G LU T 1、H K 2 蛋白表达注:A:ctrl组,B:si-NC组,C:si-SNHG1组,D:si-SNHG1+inhibitor-NC 组,E:si-SNHG1+miR-7 inhibitor 组SNHG15gaAGCACUACUGACUUGGUCUUCCu3miR-73UgUUGU-UUUAGUG-AUCAGAAGGU 5!图8SNHG1与miR-7的结合位点表3荧光素酶活性比较(xs,n=6)组别SNHGI-WTmimic-NC组1.020.13miR-7mimic组0.480.074a：与mimic-NC和SNHG1-WT共转染组比较，P0.05隐匿，放疗联合化疗是局部晚期CRC患者和部分不能手术的早期CRC患者的主要治疗手段，但相当多的CRC 患者存在放疗抵抗,大大降低了治疗效果 9-10 。因此,探究新方法改善CRC放疗抵抗的意义重大。大量研究表明,lncRNA参与了多种肿瘤的调控过程,在 CRC放疗抵抗过程中也发挥了重要作用 H2。有研究表明,lncRNAOPI5-AS1表达在抗辐射CRC细胞系中下调，其抑制细胞活力，促进放射性诱导的细胞凋亡 13。还有研究表示,IncRNAUCA1在CRC组织和细胞中过表达，其下调可通过抑制CRC细胞增殖，促进调亡和周期停滞来增强CRC细胞的放射敏感性 14。SNHG1在CRC 组织和细胞系中均过表达,敲除SNHG1后,CRC 细胞的增殖、侵袭和迁移能力都有所降低 15。GLUT1 是葡萄糖主要转运蛋白,而HK2是糖酵解途径的第一个酶,同时也是糖酵解的限速酶,已有研究显示糖酵解与肿瘤放疗抵相同剂量照射条件下，与ctrl组、si-NC组比较,si-SNHG1组HT29细胞SF显著降低,SER为1.6 35，且经6 Gy射线照射后，敲低SNHG1细胞PE显著降低，提示敲低SNHG1可增强HT29细胞的放射敏感性。lncRNA可作为“miRNA海绵”来调节基因表达参与肿瘤细胞的多种生物学进程 17 。有研究表示，LncRNAEGTO是miR-211-5p的海绵,miR-211-5p抑制剂减弱了敲低EGTO对CRC放射敏感性的增强作用 18 。研究证实,miR-7可通过靶向TRIP6来抑制CRC细胞的增殖和迁移 19,SNHG1通过海绵miR-137增加了CRC中的RICTOR水平,并促进CRC中的肿瘤发生 2 0 。本研究通过生物信息学分析发现,SNHG1与miR-7存在调控关系，通过 si-SNHG1与miR-7ABCDSNHG1-MUT1.010.121.030.11Einhibitor共转染于HT29细胞探究其对CRC放疗抵抗的影响。结果显示，敲低SNHG1可靶向调控miR-7表达,且抑制miR-7表达减弱了敲低 SNHG1对HT29细胞克隆、增殖和有氧糖酵解的抑制作用，降低了细胞调亡作用。提示敲低SNHG1可能通过上调miR-7抑制HT29细胞克隆、增殖和有氧糖酵解，促进细胞调亡。综上所述，敲低SNHG1可能通过靶向调控miR-7,进而改善CRC的放疗抵抗。然而本研究尚存在不足之处，仅仅在细胞水平上验证了SNHG1/miR-7对HT29细胞生物学的影响，后续研究将会在体内水平上进一步探索。参考文献1 Park SY,Lee CJ,Choi JH,et al.The JAK2/STAT3/CCND2 Axispromotes colorectal Cancer stem cell persistence and radioresistanceJ.J Exp Clin 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growth and metastasis by sponging miR-7J.Cell Death Dis,2018,9(4):417.9高超，韩春,王澜，等.Msil通过靶向调节p21对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响 J.中华肿瘤防治杂志,2 0 2 0,2 7(15)：12 0 9-12 17.10 Mohammadi C,Mahdavinezhad A,Saidijam M,et al.DCLK1 Inhi-bition sensitizes colorectal cancer cells to radiation treatment J.Int J Mol Cell Med,2021,10(1):23-33.1l Liu F,Huang WF,Hong JS,et al.Long noncoding RNALINC00630 promotes radio-resistance by regulating BEX1 genemethylation in colorectal cancer cellsJJ.IUBMB Life,2020,72(7):1404-1414.12周晓华，黄亮，田由京，等.LncRNAPCAT1对结直肠癌Colo320细胞的影响及作用机制研究 J.中国现代普通外科进展，2 0 2 2,2 5(8):600-607.13 Zou YM,Yao S,Chen XQ,et al.LncRNA OIP5-AS1 regulates ra-dioresistance by targeting DYRK1A through miR-369-3p in col-orectal cancer cellsJJ.Eur J Cell Biol,2018,97(5):369-378.14 Yang XD,Liu W,Xu XH,et al.Downregulation of long non-cod-ing RNA UCA1 enhances the radiosensitivity and inhibits migra-tion via suppression of epithelialmesenchymal transition in col-orectal cancer cellsJJ.Oncol 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3)（本文编辑：周立波；技术编辑：张珂）687（上接第6 8 1页）MEG3对AGS细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用可能与靶向下调miR-27a-3p表达有关。综上，过表达MEG3可能通过靶向下调miR-NA-27a-3p抑制AGS细胞增殖、迁移及侵袭能力。由于调控GC进展的相关RNA及蛋白因子较多，仍需后续深入研究。参考文献1 Dastmalchi N,Khojasteh S,Nargesi MM,et al.The correlation be-tween IncRNA and Helicobacter pylori in gastric cancerJ.Pathog Dis,2019,77(9):1-9.2 Su X,Zhang J,Yang W,et al.Identification of the prognosis-relatedIncRNA and genes in gastric cancerJJ.Front Genet,2020,11(27):1-11.3 Zhang Y,Han T,Li J,et al.Comprehensive analysis of the regulato-ry network of differentially expressed mRNAs,IncRNAs and circR-NAs in gastric cancerJ.Biomed Pharmacother,2020,122:109686.4 Sun D,Miao Y,Xu W,et al.Comprehensive analysis of competitiveendogenous RNAs network reveals potential prognostic lncRNAs ingastric cancerJ.Heliyon,2020,6(5):e03978.5 Han T,Zhou M,Yuan CC,et al.Coordinated silencing of the Sp1-mediated long noncoding RNA MEG3 by EZH2 and HDAC3 as aprognostic factor in pancreatic ductal adenocarcinomaJ.Cancer 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