第七章电子显微镜免疫组织化学技术.pptx

第七章第七章 电子显微镜免疫组织化学技术电子显微镜免疫组织化学技术一、电子显微镜免疫组织化学技术慨述二、几种常用的透射电镜方法要点一、电子显微镜免疫组织化学技术慨述免疫组织化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学显微镜分辨率的限制，不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。因此，Singer于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白(ferritin)标记抗体的方法，为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫组织化学技术(以下简称免疫电镜技术)区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：（一）组织固定与取材（一）组织固定与取材（二）免疫染色（二）免疫染色（三）包埋（三）包埋（四）对照试验（四）对照试验（一）组织固定与取材（一）组织固定与取材既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。因此，选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛戊二醛混合液和过碘酸赖氨酸一多聚甲醛液(Periodate-Lysine-Paraformaldehyde,PLP液)或4多聚甲醛液。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择地使糖类固定，就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。（二）免疫染色（二）免疫染色电免疫组化 镜分为三种:包埋前染色 包埋后染色 超薄冰冻切片 1包埋前染色 将固定组织经振动切片机切50um切片后，先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构往往保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片，寻出免疫反应阳性部位。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片，可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，可取相连续的超薄切片，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。包埋前染色法的优点是：切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。2包埋后染色 组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又名之载网染色(on grid staining)。必须指出的是：后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见，一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为，从理论上讲，四氧化锇具有保存抗原的作用，但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此，免疫组化工作者曾试图以不同的方法，如，饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂，取得不同程度的效果。为克服后一缺点，现普遍采用的是在进行免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去除四氧化锇和增强树脂的穿透性。3超薄冰冻切片 按照Tokuyasu建立的方法，将组织置于2.3moIL蔗糖液中，以液氮速冻，在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条件要求较高、难度较大。（三）包埋（三）包埋1树脂包埋2低温包埋1树脂包埋 国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。2低温包埋 常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代，80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国外已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate，GMA)，Lowicryls，LR White和LR Gold等，目前国外生产厂家有Polysciences INC，Reichert-Jung和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下：（1）Lowicryls 是丙烯酸盐(acrylate)和甲基丙烯酸盐(methacrylate)化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列产品。其特点是能在低温下保持低粘度(K4M：35；HM20：70；K11M、HM23：6080)和具有在光照射(紫外光，波长360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关。其中K4M和K11M具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因为它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多，现介绍如下：1)包埋剂的配制：由三个部分组成：单体(Monomer)，交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：K4M：单体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器以避光，用玻棒轻搅35 min或用一小管通人液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。2)生物样品处理程序 动物麻醉取材，以多聚甲醛一赖氨酸过碘酸钠在9固定2 h。PBS含7蔗糖，pH 7.2，冲洗过夜，0 0.1 molLPBS，pH 7.2冲洗，0 脱水：65乙醇1h，0 80乙醇，2 h，35 K4M：80乙醇=l：l 1 h，35 K4M：80乙醇=2：1 1 h，35 100 K4M 1 h，35 100 K4M 过夜，35 包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织移入，在一30一40以紫外线灯波长：360nm 215W(Ladd Research Industnes Burlington VT)相距3040cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85 cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射23天，可增加其硬度，便于切片。3)免疫染色 切片(厚5070nm)贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸(0.250.45um)滤过。正常羊血清30 min。第一抗血清(PBS稀释)，372h。可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡lh。正常羊血清30min。第二抗血清以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育lh。冲洗如。覆于2OsO4水溶液上，30min。冲洗如。干燥后在电镜下观察。Lowicryls应保存在暗处，一4，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。（2）LR white和LR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂，具有极低的粘度和较强的嗜水性，因此有较强的穿透性，有利于抗体(或抗原)和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70乙醇即可，能较好地保持抗原性。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。（3）GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycol Methacrylate 即2-hydroxyethyl methacrylate,HEMA)的缩写。GMA作为电镜包埋剂的优点：电子密度大；影像反差好。主要缺点：包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。缺乏稳定性，不能承受电子束的轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而GMA包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水使之变软，Spaur和Marlarty(1977)在此基础上除了加用丁基甲基丙烯酸酯和少量水外，并加人适量的增塑剂如聚乙二醇400(PEG400)以改变其硬度，加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethaerylate)以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构，选用低温型引发剂过氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide)，温度范围一10一300。经过不断的配制改进，现GMA已广泛应用于半薄切片(13 um)的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下：1)GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5 min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。2)包埋剂的配制：a.100GMA N-甲基丙烯酸丁酯 66.5ml 5乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml 1.5过氧化苯甲酰 1.0g 1.0PEG 400 1.0ml bA液：GMA单体液 90ml PFG z300 59.4 ml 过氧化苯甲酰 0.20.69 g 搅拌溶解后置棕色瓶内；4保存。B液：PEG z400 20 m 二甲基苯胺 1 ml 应用时A：B按10：1比例充分混。3)生物样品处理：组织固定可用PLP液或1戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制，pH7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4进行。4)包埋聚合：组织移入盛满包埋液的胶囊内，先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4，以紫外线灯(波长360nm)在距胶囊底部1020cm处进行照射1216h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中以去除胶囊外壳。5)切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique,PAg法）进行包埋后染色，其区别于EPON包埋剂者，在于GMA包埋切片染色所需时间较短，在第一抗血清中，GMA室温只需孵育lh，而EPON包埋切片需1620h：在第二抗血清，即PAg复合物中室温30min，而EPON包埋切片需lh。铀、铅双染后，电镜观察。低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。（四）对照试验（四）对照试验 为确定方法的特异性，免疫电镜技术也需要进行对照试验。总之，不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾。如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响，而H202能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中，应同时注意到这两个方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底，否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应产物的显示和观察。二、几种常用的透射电镜方法要点 （一）铁蛋白标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术 （二）过氧化物酶标记免疫电镜技术（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术 （三）胶体金标记免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术 1原理 铁蛋白是一种含铁约占23的蛋白质，分子量460kD，直径1012um。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径的核心为5560nm含2 0003 000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。其优点是铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；其缺点是分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞内抗原的定位较困难。2方法 常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。（1）直接法：即将切片直接浸于标记的特异性抗体内，于室温或37作用12h以上，缓冲液洗净，再按常规电镜后固定、脱水、包埋。（2）间接法：将切片经一抗室温孵育3060min后，充分洗涤(330min)，浸入标记二抗室温孵育30min，充分洗涤、后固定、脱水、包埋。（二）过氧化物酶标记免疫电镜（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术技术 1原理 利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成有较高电子密度的产物。2方法这里简单介绍包埋前和包埋后PAP免疫染色法。（1）包埋前PAP法：组织灌注固定。振动切片机切3050um厚片。入正常羊血清(510，PBS稀释)室温孵育30min。（2）包埋后PAP法：载有超薄切片的镍网入5H2O2液内蚀刻23min，生理盐水洗，滤纸吸干。5正常羊血清(TBS稀释)，室温5min。加一抗(TBS稀释，内含l正常羊血清)，4孵育48h，后用TBS洗。5正常羊血清，室温5min。加二抗(TBS稀释)室温5min，后用TBS洗。5正常羊血清，室温5min。加PAP复合物(与一抗同种属动物制备，含1正常羊血清)室温3min。H2O2一DAB显色，室温3min。入0.1molL磷酸盐缓冲液稀释的1四氧化锇液1015min后，蒸馏水洗，电镜观察。加一抗，4湿盒中4872h。加二抗，室温孵育30min。PAP复合物(与一抗同种属动物制备)室温孵育30min。H2 O2DAB，室温作用15min。光镜下选出阳性部位，修整后按常规电镜程序，四氧化锇后固定、脱水、包埋、超薄切片、观察。（三）胶体金标记免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术 1原理：胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附，从而标记抗体。用金标记的抗体与抗原反应时，光镜观察呈樱红色。由于金颗粒具有很高的电子密度，电镜观察清晰可辨。金颗粒可分为三种，小颗粒直径35nm，中颗粒10nm，大颗粒20nm。胶体金可标记许多大分子，如蛋白A、免疫球蛋白、植物凝血素、毒素、激素、多糖、糖蛋白、脂蛋白等。最常用的是蛋白A一金和Ig一金。可以利用不同直径的金颗粒标记不同抗体研究不同物质共存于同一细胞组织；也可以与PAP法相结合进行双重或多重超微结构定位。2方法：可采用直接法或间接法。间接法灵敏性高，即经一抗孵育后，再用金标记IgG与一抗结合以定位检测抗原。免疫染色可分包埋前法或包埋后法，由于包埋前染色时胶体金对质膜的穿透力较差，只用于细胞表面的抗原标记。现在普遍采用包埋后染色法。金标记法程序较PAP法简单，又不用H202作底物以显色，因而减少了对超微结构的损伤。金标记法还可用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。胶体金标记蛋白A作为第二抗体，无种属特异性，加之特异性强、灵敏度高、方法简便、背景清晰，目前应用较广。