RNA甲基化研究现状与实验可行性.ppt

RNA甲基化与MeRIP-Seq测序技术甲基化DNA免疫共沉淀技术（MeDIP）、RNA结合蛋白免疫共沉淀技术（RIP）和RNA测序技术（RNA-seq）1 12 2目 录一、一、探究与技术探究与技术研究历程研究历程 （方法：使用关键词“MeRIP”在NCBI上检索到21篇相关文献，形成综述）38页二、探究与技术二、探究与技术服务历程服务历程 （方法：找到并查看提供此类服务的三家公司，发布服务的思路与消息）99页三、研究与技术服务意义三、研究与技术服务意义（方法：综合学术界发展势态与技术服务发展势态）1010页四、实验原理与本质四、实验原理与本质PeakPeak峰出现的原理峰出现的原理（方法：综合NCBI上检索到21篇文献中的相关技术言论，着重解释了实验原理与Peak峰出现的原理）1112页五五、MeRIP-SeqMeRIP-Seq测序实验简易流程测序实验简易流程（方法：深入浅出，用简单的流程描述本技术）1313页六、六、北京基因组研究所流程与上海晶能生物流程北京基因组研究所流程与上海晶能生物流程（方法：找出关键技术文献两篇，详细对比实验方法和技术路线）1414页提示提示，晶能生物在NCBI上有署名文献七、七、MeRIP-SeqMeRIP-Seq可行性报告与方案可行性报告与方案 1517页（方法：综合MeDIP-Seq技术、RNA-Seq技术、m6A成熟抗体技术、mRNA成熟片段化技术提出“定量化”的执行方案）八、八、采购试剂方案采购试剂方案（方法：找出必要的24类试剂的采购供应情况，均有代理商！）1818页九、九、目前我国甲基化诊断产品注册情况目前我国甲基化诊断产品注册情况2021页（方法：在CFNA官方网站上已经可以检索到一例甲基化诊断试剂盒（PCR荧光探针法）探究与技术MeRIP-Seq测序技术甲基化转录组RNA免疫共沉淀高通量测序技术（MethylatedRNAImmunoprecipitationSequencing）研究历程分析方法：以关键词“MeRIP”在NCBI上检索文献，共检索到21篇文献，按照时间顺序查看文献研究流程。1、2012年，康奈尔大学威尔医学院康奈尔大学威尔医学院提出MeRIP-Seq测序技术，就是指全转录组m6A定位的方法，即结合m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀技术与新一代测序技术的结合（MeRIPSeq）。一、抗体的制备方法：anti-m6A抗体（来自文献1987/2011/1977）二、建库样本类型：m6A在RNA定位于成熟的mRNA中，而不在PolyA尾部。三、数据统计分析类型：Peak检测峰的分布、Peak（检测峰）统计分析与可视化、检测峰中motif基序统计分析与可视化等。提示：大量的m6A存在于细胞0.10.4%的总RNA腺苷残基中，这表明这种修饰在转录组可能普遍存在。虽然m6A发现于许多年前，但是在基于m6A修饰mRNA引发的病患研究进展缓慢。这在很大程度上是因为缺乏可用的检测m6A的方法。因为甲基腺苷不会改变其与胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基结合的能力，m6A也不适用于标准的杂交或测序的检测技术。Cell.2012 Jun 22;149(7):1635-46.Cell.2012 Jun 22;149(7):1635-46.3 32、2013年，中国科学院北京基因组研究所中国科学院北京基因组研究所提出MeRIP-Seq改进测序数据分析方法，就是指有效识别m6A修饰区域，并且统计分析和可视化测序数据。一、m6A峰在RNA不同区域分布的饼状图。二、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。三、m6A位点在特定转录本序列中的位置。提示：文章中的分析方法MeRIPPF可以实现了m6A信号或检测峰的基因注释，结果可以Excel和图形格式输出，有利于研究的进一步开展。MeRIPPF在Perl上完成，并且可从的http:/ Proteomics Bioinformatics.2013 Feb;11(1):72-5.Genomics Proteomics Bioinformatics.2013 Feb;11(1):72-5.4 43、2014年，西安交大利物浦大学西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学生物科学系和西北工业大学开发RNA甲基化差异分析软件包，就是指MeRIP-Seq测序数据分析软件、原序列比对、RNA甲基化位点检测、模体序列发现、RNA差异甲基化分析和功能分析。2015年，西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学在中国生物化学与生物物理进展上发表名为高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展的综述文章。提示：MeRIP-Seq测序技术还处于非常早期发展阶段。文章讨论了每个处理步骤背后的基本原理，以及具体实践方法和可能的替代策略，并且exomepeakR/Bioconductor包是免费提供，参见http:/www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomepeak.html。Methods.2014 Oct 1;69(3):274-81.Methods.2014 Oct 1;69(3):274-81.4、2014年，中国科学院北京基因组研究所中国科学院北京基因组研究所研究了模式植物水稻全转录组RNA甲基化（愈伤组织Vs叶片）特点，就是指甲基化位点的分布特点、甲基化与表达量的关系、组织表达差异统计分析、甲基化富集GO功能差异分析。一、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。二、m6A位点在特定转录本序列中的位置。三、甲基化富集GO功能差异分析。RNA Biol.2014 Sep;11(9):11801188.RNA Biol.2014 Sep;11(9):11801188.5 5(B)GO analysis of commonly methylated genes(CM)and selectively methylated genes in callus(CS)and leaf(LS).GOGO功能分析常见甲基化基因功能分析常见甲基化基因（CMCM）与选择性甲基化基因在愈伤组）与选择性甲基化基因在愈伤组织（织（CSCS）和叶片（）和叶片（LSLS）中的表达可视化）中的表达可视化图。图。RNA Biol.2014;11(9):1180-8.RNA Biol.2014;11(9):1180-8.提示：可以说自此（2015年初）后，MeRIP-Seq测序技术发展模式基本确定，就是采用MeRIP-Seq测序技术研究模式物种，然后在整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定，还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。6 6 5、2015年，西北工业大学西北工业大学继续讨论和研究RNA甲基化和去甲基化酶，收集数据进行荟萃分析，从系统水平寻找共同的甲基化调节方式。Mol Biosyst.2015 Jan;11(1):262-74.Mol Biosyst.2015 Jan;11(1):262-74.6、2015年，西安交通大学利物浦和中国矿业大学西安交通大学利物浦和中国矿业大学继续讨论和研究开展RNA甲基化数据库的建设，提示RNA甲基化领域的发展潜力。Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D197-203.Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D197-203.7、2015、2017年，芝加哥大学化学系、生物化学与分子生物学系芝加哥大学化学系、生物化学与分子生物学系从RNA交联和免疫共沉淀和MeRIP技术出发开展研究m6A的分子开关作用，提示作者绘制了大量相关性和对比类的图形；2017研究识别m6A位点的蛋白。Nature.2015 Feb 26;518(7540):560-4.Methods.2017 Aug 15;126:105-111.Nature.2015 Feb 26;518(7540):560-4.Methods.2017 Aug 15;126:105-111.8、2015年，西安交大利物浦大学生物科学系西安交大利物浦大学生物科学系继续讨论和研究开发了基于HMM隐马尔可夫模型的峰识别寻峰算法，意在寻找更好的寻峰算法。BMC Genomics.2015;16 Suppl 4:S2.BMC Genomics.2015;16 Suppl 4:S2.9、2015、2016、2016、2017.8年，西北工业大学西北工业大学 、西安交大利物浦大学西安交大利物浦大学、麻省理、麻省理工学院、扬州大学工学院、扬州大学继续讨论和研究基于HMM隐马尔可夫模型的差异甲基化区域分辨、病例-对照差异甲基化问题、基因注释问题、精确预测mRNA甲基化位置；差异甲基化分析。Biomed Res Int.2015;2015:852070.Anal Biochem.2016 Apr 15;499:15-23.Biomed Res Int.Biomed Res Int.2015;2015:852070.Anal Biochem.2016 Apr 15;499:15-23.Biomed Res Int.2016;2016:8367534.2016;2016:8367534.Bioinformatics.2016 Jun 15;32(12):i378-i385.BMC Genomics.2016 Aug 22;17 Suppl 7:520.Bioinformatics.2016 Jun 15;32(12):i378-i385.BMC Genomics.2016 Aug 22;17 Suppl 7:520.BMC Bioinformatics.BMC Bioinformatics.2017 Aug 312017 Aug 31;18(1):387.;18(1):387.10、2017年，奥地利因斯布鲁克医科大学奥地利因斯布鲁克医科大学从另一个甲基化位点m5C角度研究RNA甲基化并且对比和m6A的关系。技术路线：按照重亚硫酸盐测序（BS-Seq）的思路进行，可以实现C到U的转变，进而实现全转录组测序分析。Genome Biol.2017 Jan 5;18(1):1.Genome Biol.2017 Jan 5;18(1):1.11、2017年，四川农业大学和晶能生物四川农业大学和晶能生物采用公司服务的方式研究了猪肌肉和脂肪组织m6A甲基化谱，完成了多种数据分析统计：整体水平上做mRNA中m6A位点的分布和特定位点做表达量、甲基化位点的确定，还有组织差异和条件差异的GO功能分析等。BMC Genomics.2017;18:336.Published online BMC Genomics.2017;18:336.Published online 2017 Apr 282017 Apr 28.7 7 12、2017年8月，宾夕法尼亚大学细胞和分子生物学研究生院宾夕法尼亚大学细胞和分子生物学研究生院发表综述论文鉴赏表观转录组epitranscriptome：新技术和新观点。Enzymes.2017;41:269-298.Enzymes.2017;41:269-298.Epub 2017 Apr 14.Epub 2017 Apr 14.13、2017年9月，中国科学院动物研究所中国科学院动物研究所研究了斑马鱼造血干细胞和祖细胞m6A甲基化谱，又一次完成MeRIP-Seq技术的应用。Nature.Nature.2017 Sep 14;549(7671):273-276.2017 Sep 14;549(7671):273-276.Epub 2017 Sep 6.Epub 2017 Sep 6.14、2018年1月，中山大学肿瘤防治中心、中国南方地区肿瘤学国家重点实验室和国中山大学肿瘤防治中心、中国南方地区肿瘤学国家重点实验室和国防科技大学防科技大学提出研究m6A甲基化RNA位点变异的重要意义。提出：最近，N6-甲基腺嘌呤（m6A）已成为研究的热点，在许多基出生物学过程和各类疾病中起到关键作用。Nucleic Acids Res.Nucleic Acids Res.2018 Jan 42018 Jan 4;46(D1):D139-D145.;46(D1):D139-D145.15、2017年12月，香港大学医学院肝脏研究和病理区国家重点实验室香港大学医学院肝脏研究和病理区国家重点实验室使用转录组测序技术，m6A-Seq（MeRIP-Seq）和MeRIPqRT-PCR的方法共同检测目标基因的m6A修饰；提出：近年来，RNA的多样性和可逆性化学修饰成为一种新的表观遗传调控。Hepatology.Hepatology.2017 Nov 24.2017 Nov 24.拿到的两篇文献拿到的两篇文献1、2014年，芝加哥大学化学系和生物物理学研究所芝加哥大学化学系和生物物理学研究所发表综述文章由可逆m6A甲基化RNA介导基因表达调控机制，文中这种“RNA的化学标记”调剂机制中的相关蛋白被描述为“橡皮擦”、“阅读者”和“书写者”，以及mRNA的动态特征；提示：m6A甲基化RNA研究的重要意义。Nat Rev Genet.2014 May;15(5):293-306.Nat Rev Genet.2014 May;15(5):293-306.2、2016年，耶鲁大学医学院遗传学系和耶鲁干细胞中心耶鲁大学医学院遗传学系和耶鲁干细胞中心研究了哺乳动物小鼠胚胎干细胞中m6A的DNA甲基化谱。提示：研究组研究的主题是m6A的DNA甲基化谱，对m6A的RNA甲基化的研究思路有指导作用。Nature.2016 Apr 21;532(7599):329-33.Nature.2016 Apr 21;532(7599):329-33.8 8服务历程三家企业20162017年相继推出RNA甲基化服务（MeRIP-Seq服务）广州表观生物（成立于2016年11月）、广州锐博生物（成立于2004年“千人计划”专家张必良博士）和武汉生命之美（成立于2010年7月）。上海晶能生物合作过相关服务2017年4月。1、广州表观生物一、2017年9月，RNA甲基化（m6A）免疫共沉淀高通量测序（MeRIP-seq）服务方案。含基本分析内容：原始数据处理及统计、过滤后数据质量QC图、测序序列与参考基因组比对、基因组覆盖度分布。PeakCalling分析、Peak可视化、Peak统计分析、m6A的基本特征（peak在基因元件的分布、reads在基因元件的分布、Peak关联基因的特征）、差异peak分析、motif分析。没有GO功能分析。二、样本要求物种信息（仅限人、大小鼠物种，其他物种需评估）；实验样本：细胞、组织、提取后的总RNA（限定有参基因组物种）三、方案思路：实验分组设置：细胞模型实验组VS对照组，建议3:3；组织模型正常组VS疾病组，建议5:5；组内对照：IP组VSinput组（input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是必备的组分）。测序模式：PE100/150，测序数据：3-6G。2、武汉生命之美一、方案思路：meRIP建库流程meRIP分析流程（质量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）3、广州锐博生物一、服务特点:1.甲基化筛选范围广，全转录组范围筛查，通量高；2.丰富的项目经验，已与多家单位合作；3.项目周期快：30工作日完成；4.分析内容全面，更有定制化与其他组学数据的关联分析。二、推荐测序模式：HiSeq2500、SE5020Mcleanreads三、方案思路：meRIP建库流程meRIP分析流程（质量分析、peak分析、motif分析、GO功能分析、KEGG通路分析）提示：提示：MMeRIP-seqeRIP-seq基本可行，实验流程问题不大，服务的关键在于后期分析所能提供的统计数据和分基本可行，实验流程问题不大，服务的关键在于后期分析所能提供的统计数据和分析方法。值得一提的是，这三家公司没有学术上的产出，只是在网页上挂出相关的技术原理和服务流程析方法。值得一提的是，这三家公司没有学术上的产出，只是在网页上挂出相关的技术原理和服务流程（坐待时机）。然而，上海晶能生物没有挂出（坐待时机）。然而，上海晶能生物没有挂出RNARNA甲基化服务，却帮助完成高校发表高水平学术论著。甲基化服务，却帮助完成高校发表高水平学术论著。9 9研究与服务意义1、表达水平甲基化与测序检测技术的一次结合。2、但凡相关文章的发表，都是有高水平期刊杂志收录和承当；样本处理与数据分析合理，发在Nature和Cell上都不困难，2018年仍然会延续这种情况。3、投入本领域和技术研究与服务的知名高校和单位，逐步缓慢增加，他们的评价也是积极的。4、在我国的期刊杂志上，尚未出现相关技术的文献；提示技术有观望者，但能够执行的机构和单位尚未涌现。5、在上海尚无一家机构公开提供RNA甲基化相关服务，学术研究也处于无从展开的阶段。5、预测未来五年，甲基化研究可能迎来充足的研究动力和广阔应用潜力；学者们的相关文献也会从国内逐步转向国内。近两年，会有大量相关学术研究成果发表在外文高水平期刊上。1010实验原理与本质（intrinsicquality）MeRIP-Seq测序文库的制备差异点一、去除rRNA首先从样本细胞或组织中分离出RNA，考虑到总RNA中含有大量的rRNA序列，需要结合不同的方法除去其中的rRNA。含有PolyA尾的可以利用这一特点分离mRNA。不含的可以用相应试剂盒提取。二、平行测序内对照Control样本提取的mRNA随机打断后，需要分成两组。一组对甲基化修饰片段（IP片段，免疫沉淀片段）进行测序，一组对转录本片段（Control片段/背景片段，表达量片段）进行测序。不同与免疫芯片方法的原因是，任何样本的mRNA表达量和表达谱都存在差异（差异表达）。总之，RNA甲基化不仅可以引起甲基化的发生，也可以引起RNA总表达量的改变。西交利物浦，西交利物浦，高通量高通量RNARNA甲基化测序数据处理甲基化测序数据处理与分析研究进展与分析研究进展J.J.生物化学与生物物理进展生物化学与生物物理进展,2015(10):891-899.2015(10):891-899.侯建永侯建永.MeDIP-seq.MeDIP-seq检测游离检测游离SiO2SiO2所致肺成纤维细胞转分化的所致肺成纤维细胞转分化的DNADNA甲甲基化基化D.D.郑州大学郑州大学,2016.,2016.1111Peak峰出现的原理与本质（intrinsicquality）Cell.2012 Jun 22;149(7):1635-46.Cell.2012 Jun 22;149(7):1635-46.一、检测的差异性IP片段样本实现了对甲基化reads和甲基化位点（打断的随机性和广泛性）的富集与测序。Control片段样本实现了对正常当前表达的所有reads和位点的一般性检测与测序（非富集状态）。二、归一化比较与峰产生1、归一化由于手动上样不可能实现，IP样本和Control样本各自所上样本量一致，但是通过内部内参基因的归一化处理，所有数据变得可以比较。或者说，可以化作单个细胞某基因的表达数量（Control归一化数据）和单个细胞某基因的甲基化数量（IP归一化数据）。2、富集峰总之，用图示的方法，可以看到该基因的此位点出现Peak峰（本质上一种“归一化后的”甲基化位点“富集峰”）1212MeRIP-Seq测序实验简易流程：1、差异处理的样本一对或一组2、RNA提取3、mRNA纯化4、mRNA片段化与纯化5、mRNA-IP（RNA免疫共沉淀）6、mRNA-IP和mRNA-Control共同做mRNA-seq测序。注：mRNA-seq技术原理：首先从细胞或组织样本中提取总RNA，其次将mRNA反转录成cDNA双链文库：1）先用poly(T)寡聚核苷酸结合带有poly（A）尾巴的mRNA分子，将其从样品总RNA中分离出来；2）将mRNA分子随机打断成更小长度的RNA片段，用逆转录酶和随机引物合成得到cDNA片段；3）对cDNA片段进行末端修复，在将其两端分别接上测序接头，构成用于测序的cDNA。再将cDNA测序文库加入测序仪的各通道中，对cDNA进行桥式PCR扩增。mRNA-seq样本要求，RNA：浓度大于等于400ng/ul，总量大于等于20ug；OD260/280在1.82.2,28S/18S大于1.8，RIN大于7。1313北京基因组研究所流程与上海晶能生物流程1、组织收集与制备 水稻愈伤组织Vs叶片（2014.9）、猪背部肌肉Vs皮下脂肪（2017.4）2、RNA的制备（RNA分离和片段化）步骤一：样品保存切取两类组织，保存收集和存储在80C以下或液氮中，用于RNA提取。步骤二：提取核酸采用Trizol（Invitrogen）提取总RNA。使用核酸浓度检测和凝胶电泳检测总RNA质量。步骤三：富集多聚腺苷酸mRNA采用试剂盒Sigma、Invitrogen或者其他可用的mRNA纯化试剂盒。步骤四：化学片段化富集的mRNA采用化学片段化方法，处理成约100nt大小。使用裂解缓冲体系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94孵育5分钟，完成后使用，0.05MEDTA终止反应，同时使用标准的乙醇沉淀法沉淀核酸。片段化的核酸悬浮成约1ug/ul的水中，以备免疫沉淀和m6A测序。3、RNA免疫沉淀（IP）步骤一：抗体结合片段化的RNA（大约是2.5g2.5g总RNA）和 5mg 5mg纯化的anti-m6A多克隆抗体(SynapticSystems,Germany)置于IPP缓冲液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中，4孵育2h。同时使用标准的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗体。步骤二：免疫结合将免疫沉淀混合物与蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)混合，4孵育2h。步骤三：核酸洗脱使用置于IPP缓冲液（150mMNaCl,0.1%NP-40,10mMTris-HCl,pH7.4）中的0.5 mg/ml0.5 mg/mlN6-A(Sigma-Aldrich,USA)洗脱抗体结合的RNA。同时使用标准的乙醇沉淀法沉淀核酸-抗体。4、IP-RNA和输入RNA高通量测序（RNA-seq）质量检测RNA完整性使用（RIN）估计使用Nanodrop2000紫外可见（赛默飞，美国），质量控制（QC）测试由安捷伦科技（美国）完成的。输入方式纯化得到的IP样本和实验前保留的2.5g2.5g片段化总RNA，做为输入RNA进行RNA-Seq测序。上机方式测序仪：HiSeq3000测序仪，测序试剂盒：基因组测序试剂盒V2（Illumina，美国）。RNA Biol.RNA Biol.2014 Sep2014 Sep;11(9):11801188.BMC Genomics.2017;18:336.Published;11(9):11801188.BMC Genomics.2017;18:336.Published online online 2017 Apr 282017 Apr 28.1414第一步：差异样本设计与获得1、样本要求物种信息（仅限人、大小鼠、水稻等模式动植物，其他物种需评估）；实验样本：细胞、组织或提取后的总RNA。原则：限定有参基因组物种。2、样本处理梯度处理的样本、组织特异性差异样本。3、保存方式液氮或-80低温保存样本，保证RNA完整性。4、样本质量组织量100mg,植物组织200mg，血液量5ml，总RNA量300ug；总之，保证提取mRNA总量5ug。（按照每100ug总RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上计算，每10mg动植物组织可以提取总RNA的量在20ug计算，每1ml人全血可以提取总RNA的量35g计算）于桉于桉于桉于桉.磁性复合微粒在磁性复合微粒在磁性复合微粒在磁性复合微粒在mRNAmRNA纯化中的应用纯化中的应用纯化中的应用纯化中的应用D.D.西北大学西北大学西北大学西北大学,2007.,2007.第二步：总RNA提取1、实验原理：Trizol提取法，提取动物组织、血液与植物幼嫩组织总RNA。CTAB法，提取植物组织。2、实验步骤：取适量组织（如上要求，保证mRNA总量5ug）进行液氮研磨或组织匀浆的方法，按照“Trizol异丙醇沉底法”提取总RNA。以3050ulRNase-freeWater洗脱。孙博文孙博文孙博文孙博文.基于全转录组深度测序基于全转录组深度测序基于全转录组深度测序基于全转录组深度测序.mRNAmRNA.表达谱分析表达谱分析表达谱分析表达谱分析D.D.北京协和医学院中国医学科北京协和医学院中国医学科北京协和医学院中国医学科北京协和医学院中国医学科学院学院学院学院.2016.2016.3、质量检验：1）总RNA量300ug（按照每100ug总RNA中可以提取mRNA的量在2ug以上计算）。2）Nanodrop2000检验核酸浓度和纯度，OD260/280应在1.82.1之间。2）凝胶电泳检测核酸完整性，取1ulRNA样品加入2ul5XLoadingBuffer，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，完整的RNA其28S与18S的亮度比例约为2:1。并形成RNA质量报告。第三步：总mRNA的分离纯化1、实验原理：oligo(dT)通过共价作用或链亲和素生物素的相互作用固定在磁性复合微粒材料上，并以此为载体开展从动植物组织中纯化mRNA。吸附下来的mRNA可以重新被洗脱下来（消除多聚A与多聚T的结合作用）。纯化效率极高，有报道称，磁珠法是纤维法的3050倍。于桉于桉于桉于桉.磁性复合微粒在磁性复合微粒在磁性复合微粒在磁性复合微粒在mRNAmRNA纯化中的应用纯化中的应用纯化中的应用纯化中的应用D.D.西北大西北大西北大西北大学学学学,2007.,2007.2、实验步骤：取计算好的总RNA适量（如上要求，保证mRNA总量5ug），按照市售mRNA纯化试剂盒方法进行实验，如Sigma、Invitrogen两家的试剂盒。最终，得到总mRNA，以适当体积RNase-freeWater洗脱。（试剂盒内部包含有纯化步骤，不用额外纯化）。3、质量检测：不做检测，直接进入下一步。可行性报告与方案一1515第四步：总mRNA的化学片段化1、实验原理：采用化学片段化的方式，具体就是指，采用正、反向桥式探针，通过一步反转录及连接反应即可实现对mRNA样本的打断，且在反转录时同时引入两端接头，得到两端带有接头的cDNA文库。特点：取35ug总RNA样品，使用探针法去除总RNA中的rRNA以富集mRNA。用正反桥式探针随机杂交到mRNA上，并与溶液I混匀反应，得到带有两端接头、片段大小合适的cDNA，文库插入片段的大小取决于相邻两个正反桥式探针的距离，即可以通过调整两端接头的比例及接头和模板的比例，得到不同大小的cDNA文库。申请人申请人申请人申请人:深圳华大基因研究院深圳华大基因研究院深圳华大基因研究院深圳华大基因研究院 申请号申请号申请号申请号:CN201510049847.3 mRNA:CN201510049847.3 mRNA片段化方法片段化方法片段化方法片段化方法.2、实验步骤：取上一步获得的全部总mRNA，使用商品化试剂盒，裂解缓冲体系FragmentationBuffer(Ambion,USA)，94孵育5分钟，完成后用0.05MEDTA终止打断的酶反应。然后，按照标准的乙醇沉淀法沉淀纯化核酸。以适当体积的（可以大体积洗脱）RNase-freeWater洗脱，浓缩至约1ug/ul（1000ng/ul），可以真空浓缩或者有适当的加水关系（约510ul）。3、质量检测：Nanodrop2000检验核酸浓度和纯度，OD260/280应在1.82.1之间，核酸的质量应当在mRNA总量5ug的范围内。此时将片段化的总mRNA一分为二，一半2.5ug做RNA免疫沉淀（IP）；另一半2.5ug作为内标（Control）样本保留下来。BMC Genomics.2017;18:336.Published online BMC Genomics.2017;18:336.Published online 2017 Apr 282017 Apr 28.第五步：m6A位点的免疫共沉淀与富集（IP）1、实验原理：5mg 5mg纯化的anti-m6A多克隆抗体可以有效的从2.5ug总mRNA中，富集含有m6A甲基化位点的片段化序列，这项技术在长期研究RNA甲基化的学术领域里，是成熟与耳熟能详的。然后，蛋白-A磁珠与抗体的结合，可以通过磁珠吸附的方式去除抗体和洗脱核酸。（也可以理解为，析出核酸与解除抗体结合）。2、实验步骤：取一半约重2.5ug总mRNA，按照商品化anti-m6A多克隆抗体试剂盒的要求，与 5mg5mg纯化的anti-m6A多克隆抗体进行结合反应。再按照商品化蛋白-A磁珠protein-Abeads(Repligen，USA)试剂盒的要求，与蛋白-A磁珠进行结合反应。最后，使用商品化的0.5 mg/ml0.5 mg/mlN6-A(Sigma-Aldrich,USA)解除抗体结合作用，洗脱m6A甲基化位点片段化序列（IP样本）。第六步：IP样本与Control样本输入RNA-seq流程1、样本输入方式：将差异处理的A-B样本，按照A-IP样、A-Control样；B-IP样、B-Control样共四个样的方式进行RNA-seq建库测序流程。从逆转录酶和随机引物合成得到cDNA片段；对cDNA片段进行末端修复，在将其两端分别接上测序接头，构成用于测序的cDNA。再将cDNA测序文库加入测序仪的各通道中，对cDNA进行桥式PCR扩增。2、实验原理与步骤：RNA-seq建库与测序。王鹏飞王鹏飞王鹏飞王鹏飞.转录组测序转录组测序转录组测序转录组测序.关键酶基因的克隆与表达分析关键酶基因的克隆与表达分析关键酶基因的克隆与表达分析关键酶基因的克隆与表达分析D.D.山西农业大学山西农业大学山西农业大学山西农业大学,2015.,2015.可行性报告与方案二1616第七步：数据分析、Peaks峰分析、Motif基序分析、差异基因分析、GO功能分析1、实验原理：生信分析2、实验步骤：1）Reads统计与数据过滤、数据映射到参考基因组、寻找唯一映射；2）Peaks差异峰识别、Peaks差异峰统计；3）组织差异甲基化基因分析、m6A甲基化位点富集区Motif基序的偏搜索与可视化4）m6A甲基化位点全转录组分布、组织间分布差异5）甲基化基因GO功能分析、单独分析转录相关基因6）组织特异基因的GO功能分析、特异基因与信号通路的甲基化Peaks峰分析BMC Genomics.2017;18:336.Published online BMC Genomics.2017;18:336.Published online 2017 Apr 282017 Apr 28.1717采购试剂方案1、总mRNA的分离纯化试剂盒如，试剂盒GenElutemRNAminiprepkit(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)，Sigma-Aldrich在全国有多家代理，比如：安诺伦（北京）生物科技有限公司。2、总mRNA的化学片段化试剂盒如，FragmentationBuffer(Ambion,Austin,TX,USA)，Ambionz在上海有多家代理，比如：上海拜力生物科技有限公司。3、anti-m6A多克隆抗体、蛋白-A磁珠、N6-A(Sigma-Aldrich,USA)原料如，抗体：Purifiedanti-m6Apolyclonalantibody(SynapticSystems,Gttingen,Germany)，SynapticSystems在上海有多家代理，比如：上海起福生物科技有限公司。又如，蛋白-A磁珠：Protein-Abeads(Repligen,Waltham,MA,USA)，Repligen在上海有多家代理，比如：上海聚仕隆生物科技有限公司。4、mRNA建库流程成熟如，mRNAsequencingkit(IlluminaInc.,SanDiego,CA,USA)，Illumina试剂在上海有多家代理，Illumina技术支持可提供mRNA建库具体方案。1818主要引用与技术路线参考文献参考文献：1、技术路线：中国科学院北京基因组研究所研究了模式植物水稻全转录组RNA甲基化（愈伤组织Vs叶片）RNA Biol.2014 Sep;11(9):11801188.RNA Biol.2014 Sep;11(9):11801188.2、技术路线：四川农业大学和晶能生物采用公司服务的方式研究了猪（肌肉和脂肪组织）m6A甲基化谱RNA BMC Genomics.2017;18:336.Published online 2017 Apr 28.Genomics.2017;18:336.Published online 2017 Apr 28.3、综述文章：西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学西安交大利物浦大学生物科学系和西北工业大学在中国生物化学与生物物理进展上发表名为高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展的综述文章4、综述文章：芝加哥大学化学系和生物物理学研究所芝加哥大学化学系和生物物理学研究所发表综述文章由可逆m6A甲基化RNA介导基因表达调控机制 Nat Rev Genet.2014 May;15(5):293-306.Nat Rev Genet.2014 May;15(5):293-306.5、MeDIP-seq技术路线：硕士论文郑州大学/中南大学；博士论文复旦大学。6、转录组测序流程：硕士论文北京协和医学院中国医学科学院，山西农业大学等。王鹏飞王鹏飞.转录组测序转录组测序.关键酶基因的克隆与表达分析关键酶基因的克隆与表达分析D.D.山西农业大学山西农业大学,2015.2015.孙博文孙博文.基于全转录组深度测序基于全转录组深度测序.mRNA.mRNA.表达谱分析表达谱分析D.D.北京协和医学院中国北京协和医学院中国医学科学院医学科学院.2016.2016.7、mRNA片段化方法：参看华大基因专利文献申请号申请号:CN201510049847.3:CN201510049847.3申请人申请人:深圳华大基因研究院深圳华大基因研究院mRNAmRNA片段化方法片段化方法.8、总mRNA的分离纯化方法于桉于桉.磁性复合微粒在磁性复合微粒在mRNAmRNA纯化中的应用纯化中的应用D.D.西北大学西北大学,2007.,2007.1919目前报注册证的甲基化诊断产品目前报注册证的甲基化诊断产品企业名称：企业名称：EpigenomicsAGEpigenomicsAG产品名称：产品名称：Septin9Septin9基因甲基化检测试剂盒基因甲基化检测试剂盒(PCRPCR荧光探针法荧光探针法荧光探针法荧光探针法)1 1、DNADNA甲基化检测试剂盒甲基化检测试剂盒DNADNA甲基化是一种表观遗传修饰，甲基化是一种表观遗传修饰，DNADNA甲基转移酶（甲基转移酶（DnmtDnmt）催化）催化S-S-腺苷甲硫氨酸作为腺苷甲硫氨酸作为供体，将胞嘧啶转变为供体，将胞嘧啶转变为5-5-甲基胞嘧啶。甲基胞嘧啶。CGCG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化三种状态。不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化三种状态。DNADNA甲基化能关闭某些基因的甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNADNA甲基化对人类表观遗传、胚胎发育、甲基化对人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生发展都起到重要作用。基因印记、等位基因失活及肿瘤发生发展都起到重要作用。EpiMethyT