色谱柱层析.doc

氨基酸的离子交换柱色谱分离
来源：易生物实验 浏览次数：814 网友评论 0 条
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴粒子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。
关键词：离子交换色谱氨基酸离子交换柱色谱阳离子交换树脂酸性氨基酸色谱柱
一、原理
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应如：
R-SO3H+M→R-SO3M+H+
或 R-NH3OH+Cl-→R-NH3Cl+OH-
这类同分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴粒子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
二、操作
1．树脂的处理
关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2．装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1~2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2~3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定(特别是对于采用高温法)。装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3．平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止(用pH试纸检查)，这大约需要2~3倍床体积。
4．加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1~2次。洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
注意在调节流速时要排除恒流泵与柱之间连接管内的所有气泡，并且在调节时不要过猛，以免影响色谱行为。
5．收集：柱流出液可用自动分部收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。
6．改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液，然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。
7．测定：(注2)将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂，混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5~10分钟，加3ml60%乙醇稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。
测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8．再生：对于装好的柱使用几次后需用0 .2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。
［注］：1.对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，
反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时要用水先将树脂洗至中性。最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型(对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定)，以蒸馏水洗至中性备用。
2．氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后的洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
三、器材
①玻璃色谱柱：长19cm，内径1.2cm，3#砂芯。 ②恒流泵(微量输液器)。
③Bs-160型部分收集器或以刻度试管手工操作。 ④722型分光光度计。
⑤刻度吸管、试管。 ⑥水浴锅。
易生物仪器库：
易生物试剂库：
四、试剂
①树脂：磺酸型阳离子交换树脂(732型)
②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸(C6O7H8·H2O)；186克 97%NaOH； 105ml浓盐酸溶于水稀释至10升。
0.01mol/L pH12 NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。
③样品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。
④显色剂：三氯化钛——茚三酮溶液：
醋酸缓冲液：水150ml，无水醋酸钠82克，无水醋酸25ml，用水定容250ml pH5.5。
乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化钛(TiCl315%)1.7ml，用醋酸缓冲液定溶到1升。