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发展和展望：干细胞和神经系统疾病
李劲涛翻译
摘要：中枢神经系统在缓慢进展性神经系统退行性疾患，如帕金森病（PD），阿尔兹海默病或亨廷顿病（HD）或导致细胞快速丢失的急性损伤、脑血管病（入卒中）或脊髓损伤时其丢失的组织的再生能力有限。虽然成年大脑在有限的区域包含小部分的干细胞，但是这些干细胞对并不能有效地在功能恢复中起作用。干细胞移植或干细胞源性祖细胞已长期被认为是修复以上脑损伤的治疗策略。随着诱导性多能干细胞技术的出现，其作为一种新的、有潜能和更好的移植细胞之源在不远的将来将成为可能。本综述的目的是强调当前神经系统退行性疾病的细胞群替换策略，重点集中于HD和PD，以及外伤性脑损伤，如脑卒中，讨论与中枢神经系统细胞移植有关的技术和生物学问题。
关键词：细胞替换治疗，干细胞，帕金森病，缺血性脑卒中，亨廷顿病
进展：
·不同细胞类型可能对于不同的神经退行性疾病的移植研究有不同作用。
·对神经系统退行性疾病的移植研究为这一过程提供了安全和可行的实验操纵程序。
·细胞移植为亨廷顿病病人在有限的时间内提供了其症状的改善。
·在脑卒中的病人加强了内源性修复机制，并以此作为治疗靶，以进一步改善其症状。
·早期不同类型细胞移植治疗缺血性脑损伤的早期临床前实验显示，病人没有副作用，且功能的改善结果是多变的。
·细胞移植治疗PD是可行的，可导致运动功能的改善，在室内的空间环境下依然可以进一步改善。
·人胚胎干细胞(hESCs)分化为可移植性的多巴胺能祖细胞的能力的提高是本研究的一个重点。
展望：
·细胞替换治疗的必要性是由于老龄社会基于人否统计的退行性变疾病发病率的增加驱使之下产生的。
·不同的神经退行性疾病可能需要不同的细胞源，而这些细胞源是待决定的。此外，与疾病发生相关的最佳移植时点将作为未来研究的焦点。
·移植细胞分化的改善将导致更纯的可移植细胞群，这些移植细胞群可来自hESCs或甚至诱导性多能干细胞。
·逻辑学、伦理学和社会的、经济的障碍必须被克服以使细胞替换治疗真正应用于广泛的公众。
不同的细胞类型对不同的神经系统退行性疾病有作用
细胞替换治疗在将来可对减轻症状，甚至是逆转神经系统疾病的进展有帮助，而之前这些疾病的药物干预和其它治疗方法不足以对其起有效治疗作用。在过去的十年中，令人信服的证据表明，多种干细胞群在动物模型，包括PD，AD和多发性硬化和大脑缺血的动物模型中能诱导再生。
来源于胚胎干细胞(ESCs)的细胞群可满足神经细胞替换治疗所需要的细胞源【1，2】。ESCs是一种可高度被扩增的多能细胞，具有分化为人体所有细胞类型的能力，包括神经细胞组织。它们来源于前植入胚泡的内细胞团，再由内细胞团产生同源的自我更新的细胞群。作为未分化的人ESCs (hESCs)移植，其具有产生预期之外的增殖，导致癌性结构形成的高风险性，不再视为有效的治疗方法。而定向诱导hESCs分化为特异的神经祖细胞亚型逐渐为人们所接受。其它潜能性的中枢神经系统（CNS）移植的细胞源包括胎儿或成年的神经干细胞(NSCs)，间充质干细胞(MSCs)或骨髓源性细胞群等。例如，MSCs很容易获得，且其应用不会受到伦理学问题的牵涉。
NSCs能在很长的时间期限内扩增，且因其已经被同化（例如，定型为CNS细胞型），故而不需要对其发育早期信号进行强化以导致其神经外胚层行为。然而，移植胎儿源性NSCs入成年大脑伴随许多伦理学、科学和法律学障碍【3,4】。另外，NSCs的延长培养可引起大量胶质细胞型的分化，而占用了神经元的分化比率，从而显著减少胎儿NSCs的治疗效果【5】。经研究，MSCs可能证明优于NSCs，因其可来源于一系列成年组织，例如骨髓和脐血，以及胎儿的肝、肺和发育中的牙蕾。到目前为止，骨髓间充质干细胞（MSCs)是应用于造血系统疾病治疗最常用的干细胞源，因而其分离和应用已非常成熟和稳定。由于这些细胞似乎能通过血脑屏障，所以对其移植不需要侵袭性的脑内外科手术，而只需要周围系统的细胞应用。然而，MSCs无论在体外或体内移植后定向诱导分化为神经细胞型的程度在研究者中仍存在争论。
最近，干细胞领域出现一种新的细胞类型，可能对细胞移植有用。Takahashi and Yamanaka【6】成功地将小鼠成纤维细胞重新编程，使之成为与ESCs高度相似的细胞，这就是所谓的“诱导性多能干细胞”。仅过了1年之后，这项新的技术逆转了该细胞应用于人体浆细胞的细胞发育过程【7,8】。这项令人鼓舞的技术使来源于病人自己皮肤的诱导性多能干细胞的衍生物成为可能，并使这些诱导性多能干细胞后续分化为神经系统退行性疾病或散发性损伤中丧失的细胞。最终，与预期想象的结果一样，这些适合与病人的干细胞可用于一系列老年病的退行性变的细胞移植治疗。我们在本文中讨论的所有这些不同类型的细胞均可能对不同的神经系统疾病的移植研究有益（见图1）。
神经退行性疾病的移植研究为移植的安全性和可行性提供了有用的实验数据
对于将细胞替换实际应用于临床前，持续的功能和临床的改善和在试验动物模型中的有害的副作用的避免仍需进一步建立。必须进行理论和实践的研究以显示移植后细胞存活，宿主脑组织与移植物的整合，脑组织靶区的突触神经支配，以及显示移植细胞在体内的形态分化和功能性地替代因损伤丢失的细胞。良好的细胞分化实验方案将产生高度有效的细胞分化，从而得到高质量的移植细胞。行为学和潜在的功能改善可得到清晰的证明。在细胞水平深入理解功能的恢复对于神经环路重建和祖细胞引导的优化是非常重要的。最后，需要不同层次的病人应用于不同临床疗效的细胞治疗，有的细胞治疗用于疾病的早期，有的用于疾病的晚期。由于CNS疾病的病理学以不同潜在的机制为特征，因而就需要特异的干细胞及其衍生物针对不同的情况进行移植治疗，以影响疾病特异性的修复过程。本综述重点神经系统退行性疾病，如PD,HD和脑卒中的移植研究，提供迄今为止关于这些疾病移植的安全性和可行性实验操作数据和程序。
细胞移植在有限的时间范围内改善了HD病人的临床表现
HD是一种常染色体显性遗传疾病，由huntingtin位点的突变引起，可导致纹状体内γ-氨基丁酸能神经元为主的进展性的退行性变（见图2）。在HD疾病进展的稍后阶段，可观察到神经元的更广泛的退行性变，如在大脑新皮质和海马的神经元退变。随后病人产生严重的运动和认知障碍。目前仍没有有效的治疗该期HD的方法，病人通常在疾病发生后的10-20年间死亡。
由于HD早期以一种特异的细胞类型的相对特异性丢失为特征，即媒介性多针的神经元丢失，所以HD似乎是一种“单纯”的细胞丢失的疾病，适应应用特异的细胞移植替换策略以替换丢失的细胞组织，有希望成功诱导纹状体-皮质环路的长时间恢复。实际上，在动物HD模型中，移植非人的胎儿纹状体组织提供此移植物引起的解剖学和行为学的改善的理论和实验依据【9】。
自从十九世纪九十年代以来，人们移植胎儿神经组织入HD病人的纹状体进行了一系列临床试验【9】。接受胎儿神经组织移植的病人数量较少，且根据临床症状评价的移植治疗效果也各异（见表1）。在一项Marc Peschanski 和Anne-Catherine Bachoud-Le´vi在法国Cre´teil进行的初步研究中，5个病人中的3个在移植胎儿神经移植物入左侧和右侧纹状体2年后后显示出运动和认知功能的明显改善，且维持改善的高水平，在随后的4年中病人的运动功能改善渐渐减少，而认知功能却维持稳定。在这一初步研究后，研究者进行了II期临床试验，他们成功地应用附加的免疫抑制治疗对抗胎儿供者的抗原，其抗体在病人的血标本中被检测到【10】。
类似的结果在Kopyov 和 colleagues in Los Angeles的独立研究中获得。来自5-8个胎儿尸体解剖供给的侧神经节隆起分别移植入两个病人的双侧尾状核和豆状核，移植6个月后，移植物显示出显著的活力。然而，两个移植病人都显示出有限的移植物-宿主的连接性，且没有诱导临床症状的改善【11】。在其中1例病人中，移植物导致移植后10年囊泡形成和过渡生长，病人死于HD的进展【12】。
Reuter等【13】报道了一个例外的病例，两例接受双侧纹状体胎儿组织移植的病人在移植后5年运动功能和纹状体PET扫描结果改善，Capetian等【14】报道，在1例病人的尸检发现，移植后6个月，移植的组织分化并与宿主组织整合，不伴运动或精神症状的改善。
最近的研究分析了来自3个死前接受移植的病人的大脑，结果显示，虽然移植的细胞分化和与宿主组织整合，但是它们比病人自己的组织退变更快【15】。在伴有相关脑组织明显萎缩的HD病人的较晚期进行细胞移植可能是外科手术高副作用发生率，如移植入严重萎缩的尾状核后的血肿和较低的存活率。因此，移植似乎只能提供有限时间段的症状改善，但是并不是一种有效的HD疾病治疗策略。不伴有不正常基因表达的纹状体移植随时间而改变的事实提示，局部环境，包括小胶质细胞针对移植物的激活和来自大脑皮质的兴奋性毒素谷氨酸能输入不支持移植物的长期存活。最新的研究结果提示，HD细胞移植的临床应用有相当大的障碍，特别是研究表明，HD的早期移植是有希望的。
增强内源性修复机制时是未来改善脑卒中病人症状的重要途径
神经元和神经胶质细胞的退行性改变可发生于脑血管损伤后，主要由选择性脑区血流的阻滞引起，可导致运动，感觉和认知障碍。随着时间的延长，脑萎缩引起进一步的长期损害，而目前治疗方法仅限于溶血栓药的治疗，其治疗的时间窗狭窄，不适用于所有病人。尽管脑缺血的局灶性病变占优势的特点，许多细胞类型都会受到缺血的影响，从理论上说，神经系统疾病并不是细胞替换治疗理想的候选者。然而，据推测，重建一小部分丢失的环路就足以促进病人功能的恢复。
研究已显示，脑卒中诱导刺激神经发生和神经干或祖细胞迁移入病人缺血损伤的区域，但是神经发生能多大程度替换丢失的神经元，或对功能改善起多大作用目前仍不清楚【16,17】。如果神经发生的神经元细胞替换妥协于局部缺血的环境，那么这些移植细胞将被通过脑内灌注细胞因子或移植过表达神经营养因子，如脑源性神经营养因子（BDNF），神经生长因子（NGF），血管内皮细胞生长因子（VEGF）和胶质源性神经生长因子（GDNF）【18,19】。
不同种类的细胞移植治疗缺血性脑卒中显示对病人没有副作用，而对功能的恢复是高度可变性的
在脑卒中的病人中通过移植物替换损伤的组织的想法仍相对探索较少。几乎没有早期临床试验提供试验资料显示细胞移植的安全性和可行性。只有一小部分病人接受了早期细胞移植治疗。例如，将来源于人永久化畸胎癌细胞系(NT2/N)的神经祖细胞移植入基底节卒中的12个病人，移植物存活6个月到4.5年。在移植后5年未观察到移植引起的副作用，经欧洲卒中测量，病人显示出一定程度功能的恢复。在随后的随机II期临床试验中，共有18位病人在卒中后1-6年接受5百万或一千万的人神经元细胞移植。结果发现，没有移植细胞相关性副作用出现，但是移植程序的副作用包括惊厥和硬膜下血肿在两例病人中被观察到。总之，14例病人中有6例显示在移植后6周European Stroke Scale（欧洲卒中评分）的增加，但是欧洲卒中运动评分却没有增加；然而，每天的记忆实验评分却显著增加。在一个独立研究中，Savitz等【20】将猪的细胞经抗MHC1抗体预处理以避免免疫排斥反应后，于脑卒中发生后1.5-10年移植入5例基底节卒中的病人。其中两个病人显示移植后运动缺陷的加重或短暂的惊厥发作。因此，这一实验被食品和药管居禁止。
Bang等【21】在一个I/II期临床实验中将自体的来源于5个病人骨髓的MSCs移植入30例脑梗塞病人的大脑中动脉区域。结果发现没有观察到副作用，经过1年的最总估计显示功能没有显著的恢复。
所有这些临床试验提示，干细胞治疗对于脑缺血是可行的，目前可获得的有限的实验资料因而进一步提供了对临床治疗有益的支持性证据【22-24】。还需要进一步的研究以确定最佳的移植细胞类型和移植途径，以改善脑卒中细胞治疗的效果。此外，缺血后最佳的移植时点也应该被确定，因为激活的小胶质细胞可能限制移植细胞的存活。
对常见的动物模型的基础研究，如小鼠和大鼠的研究，将给干细胞治疗所起有益效果的潜在机制提供进一步的了解。例如，对大脑皮质梗塞小鼠全身应用骨髓单核细胞治疗可增加内皮细胞和神经祖细胞(NPCs)在梗塞区域的增殖【25】。Nakagomi等【26】研究显示，联合内皮细胞和NPCs移植可增加缺血诱导的NPCs的存活，其NPCs存活数目较单独移植NPCs组多。据推测，内皮祖细胞可增加血管生成，进而促进神经血管的修复【27】。GDNF对细胞存活的一种可能的作用已通过在大脑中动脉闭塞的大鼠应用GDNF和经移植前GDNF修饰NPCs后，移植入大脑中动脉闭塞大鼠的实验研究所证实【28,29】。以上结果提示，营养因子的作用，而不只是细胞替换本身的作用对动物模型的行为学改善起重要作用。因此，合并应用细胞因子刺激内源性神经发生和干细胞技术将可能对将来脑卒中病人的治疗起极大的作用。
细胞移植治疗PD是可行的，可导致运动功能改善，并有进一步改善的空间
胎儿组织移植治疗PD在神经系统疾病的细胞替换治疗中最先得到开展。PD主要由中脑黑质多巴胺能（DA）神经元的退行性变和新纹状体尾状核和豆状核的DA神经传递进展性丧失所引起（间图2）。病人表现为运动功能障碍，如颤栗，强直和运动迟缓，同时伴有睡眠和认知障碍。迄今为止，L-DOPA和其它多巴胺激动剂可使病人运动症状减轻，但是只是在该病发病早期有效。深部脑刺激是PD病人附属治疗的另一选择。由于在PD中，发生单纯神经元类型的相对特异性丢失，研究者们推测，DA神经元的细胞替换治疗对PD使可行的。
从十九世纪七十年代开始，有丝分裂后的胎儿腹侧中脑细胞悬液当移植入PD动物模型后证明产生显著的行为学改善，并于十九世纪八十年代中期将这一实验技术转化到临床应用。
世界范围内，总共有300-400例病人接受过胎儿细胞移植【30】。公开的临床试验显示，对运动症状来说功能改善；然而，双盲的临床试验与安慰剂组相比却没有显示出显著的功能改善【31】。总之，临床结果的高度可变性，以及在一些病例中发生了运动失调，低移植物存活率伴有产生最佳的临床结果大量人胚胎的需要（一个核需要1-8个胚胎），提示需要探寻可选择性的和更加可靠的细胞源【32】。最近，为了得到移植治疗的最佳效果，强调了严格的病人选择和外科参数，如移植点，移植针道的数目和细胞沉着物等因素的重要性【33】。
从发育中的大脑分离组织以产生可扩增的NSCs群是随着临床研究的发展而合乎逻辑的进展。许多用于移植的多能的NSCs及其衍生物来自发育中的中脑【34】。尽管人NSCs在体外是高度可扩增性的，且实验步骤已得到发展以富集DA神经元祖细胞，但是产生的DA神经元的数目最多只占细胞总数的15%【35,36】。因此，这种方法似乎对PD治疗方法的发展不利，而未来的治疗要使用胚胎干细胞或甚至诱导性多能干细胞源性多巴胺能细胞。
人ESCs分化为移植性的DA祖细胞的研究是一研究热点
目前对于CNS移植治疗PD的主要策略是自ESCs产生可移植的DA祖细胞。成功将ES应用于PD细胞替换治疗的关键是有效和稳定地产生中脑A9 DA神经元。据报道，绝大部分分化的程序是将DA神经元暴露于可溶性的生长和营养因子下以驱使其分化。
Roy等【37】证明，hESCs在sonic hedgehog和成纤维细胞生长因子-8的作用下形成胚状体可加强中脑神经元的生成（大于67%的神经元为TH阳性），且在PD啮齿类模型中，这些细胞能显著逆转损伤诱导的行为学缺陷。然而，移植物也含有大量残余的分裂活跃的神经上皮细胞，它们在移植后继续增殖。另外，一些研究组显示联合移植hESCs和另外一种细胞“滋养”层可增加细胞系特异性向中脑细胞的分化。ES细胞与DA诱导的PA6小鼠基质细胞系共培养可促进小鼠，灵长类和人ES细胞分化为功能性的DA神经元【38】。PA6培养的细胞移植PD损伤性动物显示显著的行为学恢复，尽管在一些接受移植的动物内，移植仍然可导致畸胎瘤的形成【39】。进一步生成A9DA神经元的策略包括基因转移和在早期中脑发育中的重要的遗传标记的过表达。ESCs转染编码转录因子的cDNAs（在早期中脑细胞系的特异性分化中很重要）显示DA分化的增强。分化为DA神经元的那部分细胞在用Lmx1a 或Nurr1+Pitx3转导后显示显著增加（所有神经元的50%-65%是TH阳性细胞）【40,41】。当这些细胞移植入PD损伤小鼠的纹状体后，可观察到显著的药物诱导旋转行为改善。
总之，这些发现提示，从ES细胞可产生大量的DA神经元，但是污染性的非DA细胞的存在和移植细胞的继续增殖提示，进一步精炼这些分化的实验程序在将这些些用于临床前是必要的。也需要进行深入的研究以探索基因操纵干细胞临床应用的潜在安全性和危险性。
结论
实验动物的理论和实验研究已显示，用不同来源的干细胞替换退行性变的神经组织是可行的，且能导致多丧失功能的改善。在病人中，早期移植试验显示变数极大的实验结果，可从显著的临床表现改善到症状的加重并伴有严重的副作用。由于PD，HD和脑卒中的病理生理变化不同，可根据需要选择不同的细胞类型以达到最佳的临床改善作用。细胞替换治疗要真正成为临床应用的策略前尚需进行必要的基础性研究。
展望
干细胞治疗的应用和药物的发展引起当今的生物科学界极大的兴趣。在最近几年中我们对于干细胞生物学和再生医学的知识了理解显著地增加。ESCs不仅继续分离，它们还能分化为大约220种不同的人类细胞类型。对组织干细胞的分离提供了伦理学分泌争议较少和更加实用的器官组织替换的细胞源，这些细胞源异受年龄相关性疾病或外伤性损伤的影响。这些疾病包括AD，脑卒中，心肌梗塞和糖尿病等，由于现在人的寿命逐渐延长，它们已经成为当今社会严重的健康问题。大部分的干细胞研究的目的是识别理想的可共移植的细胞型，以及移植的时机。未来的研究将导致实验程序的改善，以产生更多的纯的可移植的细胞群。随着干细胞研究的持续发展，现代临床医学正在经历很大的变革。

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