荧光PCR熔解曲线原理.doc

熔解曲线耐药结核检测技术的原理及应用
随着抗结核药物的广泛使用，耐多药结核病人不断增加。耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指至少同时对利福平（rifampin，RIF）和异烟肼（isoniazid，INH）这两种一线抗结核药物耐药。传统的药物敏感实验（Drug susceptibility test，DST）时间长，不利于耐多药结核病患者的及时诊治。 因此，发展一种快速检测耐多药结核病的分子生物学检测技术对于耐多药结核病的早期诊断和治疗十分重要。
一、熔解曲线耐药结核检测技术的发展
结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒和结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒于2013年1月获颁国家食品药品监督管理局（SFDA）医疗器械注册证书，同时，“中国—比尔盖茨基金会”已将该试剂盒纳入该基金会2013年产品验证目录。2016年9月，SFDA批准了另外三种试剂盒：“结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药突变检测试剂盒”、“结核分枝杆菌链霉素耐药突变检测试剂盒”和“结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒”，分别用于检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物、链霉素药物和乙胺丁醇药物耐药性，可用于临床上结核病的辅助诊断。这些产品上市，有利于对耐多药结核病患者及时诊治，从而更好地控制与治疗结核病。
二、熔解曲线耐药结核检测的工作原理
结核分枝杆菌异烟肼、利福平、氟喹诺酮、链霉素、乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒均采用荧光PCR熔解曲线法进行检测。荧光PCR熔解曲线法是一种简单快速的PCR检测技术，其主要检测原理为耐药基因的基因突变会导致DNA双链的结合力下降，从而导致相应的DNA熔解温度（Tm值）下降，即野生型基因有特定的Tm值，而突变型基因因为结合能力下降导致Tm值发生变化[1]，Tm值下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关，据此可以区分和检测出突变型和野生型。
三、熔解曲线耐药结核检测产品结构
结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒包含：① 扩增试剂：PCR Mix A、PCR Mix B及TB酶混合液；② 对照试剂：阳性对照，含四个野生型扩增靶基因的质粒；③ TB阴性对照：不含靶基因的溶液。
四、熔解曲线耐药结核检测的突变位点[2]
抗结核药物
检测的突变位点
RFP
rpoB 507～534核心区位点
INH
ahpC启动子区（-44～-30以及-15～3位点）、inhA94密码子、inhA启动子区（-17～-8位点）以及katG315 密码子
EMB
embB306、embB378- 380、embB406及embB497四个常见突变位点
SM
rpsL43、rpsL88密码子，rrs513～517位点和rrs905～908位点
五、熔解曲线耐药结核检测的优点
① 熔解曲线检测试剂盒是目前市场上检测项目最齐全的试剂盒，可实现MDR和XDR
一步检测
② 实验全程采用闭管法操作，无PCR后处理，降低了扩增产物交叉污染的发生率[3]
③ 检测时间较短（在3小时内完成），可实现自动判读
④ 可在现有的实时荧光定量PCR分析仪上操作，不需要昂贵的专用设备
熔解曲线法与现有其他检测方法相比，检测项目更为齐全，并且可在3h左右获得药敏结果，适用于耐多药结核病的快速筛查，有利于更快的对耐多药患者进行诊断治疗并减少耐多药患者的传播。这种检测方法对于我国结核病患者和结核病策略的影响还需要进行大范围的、进一步的调查研究。

参考文献：
[1] 蔡挺，李巧云，张顺，等。基因芯片技术检测常见革兰阴性杆菌 耐药基因的研究[J]。中华医院感染学杂志，2011，21（21）：4411-4414
[2] 严虹，施旭东，胡春梅，等。探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素耐药突变。临床检验杂志，2015，33（10）：729-733
[3] Qiu YH，Zan ZL，Yi QL，et  al．Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled， self-quenched probes [J]. PLoS One, 2011, 6( 4) : e19206