circ-E2F3促进宫颈癌细胞增殖的机制研究.pdf

肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4circ-E2F3促进宫颈癌细胞增殖的机制研究缪华珍1，刘敏2（1江阴市妇幼保健院，江苏 无锡，214400；2南京市第二医院，江苏 南京，210003）摘要：目的研究circ-E2F3通过抑制miR-296-5p影响宫颈癌进展的作用机制。方法采用qRT-PCR检测宫颈癌组织和癌旁组织中circ-E2F3的表达量，筛选宫颈癌细胞系，通过qRT-PCR检测宫颈癌细胞系和正常宫颈黏膜上皮细胞中circ-E2F3的表达量。采用CCK-8检测细胞活力，通过检索数据库筛查circ-E2F3可能的分子机制，并通过双荧光素酶分析、qRT-PCR等方法证实其调控机制。结果circ-E2F3在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系CaSki中表达上调。体外实验证实circ-E2F3能促进宫颈癌细胞增殖；体内实验证实circ-E2F3通过抑制miR-296-5p促进肿瘤细胞生长。结论circ-E2F3通过抑制miR-296-5p在宫颈癌的进展中发挥重要作用，高表达的circ-E2F3可能是判断宫颈癌进展的重要指标。关键词：circ-E2F3；miR-296-5p；宫颈癌；增殖中图分类号：R737.33 文献标识码：A Mechanism of circ-E2F3 promoting the proliferation of cervical cancer cellsMIAO Huazhen1,LIU Min2(1Jiangyin City Maternal and Child Health Hospital,Wuxi,214400,Jiangsu,China;2Nanjing Second Hospital,Nanjing,210003,Jiangsu,China)Abstract:Objective To study the effect of circ-E2F3 on the progression of cervical cancer by inhibiting miR-296-5p.Methods The expression levels of circ-E2F3 in cervical cancer tissues and adjacent tissues were detected by qRT-PCR,and cervical cancer cell lines were then screened.The expression levels of circ-E2F3 expression in cervical cancer cell lines and normal cervical mucosal epithelial cells were detected by qRT-PCR.Cell viability was detected by CCK-8.The possible molecular mechanism of circ-E2F3 was screened by searching the database,and its regulatory mechanism was confirmed by dual luciferase analysis and qRT-PCR.Results The expression of circ-E2F3 was up-regulated in cervical cancer tissues and cervical cancer cell line CaSki.In vitro experiment found that circ-E2F3 can promote the proliferation of cervical cancer cells.circ-E2F3 promoted the tumor growth in vivo by inhibiting miR-296-5p.Conclusion circ-E2F3 played an important role in the progress of cervical cancer by inhibiting miR-296-5p.Highly-expressed circ-E2F3 may be an important indicator to predict the progress of cervical cancer.Keywords:circ-E2F3;miR-296-5p;Cervical cancer;Proliferation前言宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带鳞状上皮细胞及颈管内膜柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，是常见的妇科恶性肿瘤之一1。中国宫颈癌发病病例在全球约占12%，宫颈癌相关死亡病例约占 11%2。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是人类癌症（包括宫颈癌）中一种重要的生物标志物。研究发现，circRNA参与宫颈癌等多种恶性肿瘤的发生和发展3。circRNA-AKT1可阻断miR-942-5p基础研究作者简介：缪华珍，女，副主任药师，研究方向：医院药学。DOI：10.3969/j.issn.2095-1264.2023.04.07文章编号：2095-1264（2023）04-0443-06 443肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4对AKT1的上调作用，促进宫颈癌的发展4。E2F家族是高等真核生物中编码一系列转录因子并参与哺乳动物细胞周期和 DNA 合成调控的一组基因。E2F转录因子 3（E2F3）是 E2F家族成员之一，在控制细胞周期进程中发挥重要作用，并且可调节不同类型癌症的转移5。微小RNA（microRNA，miRNA）的分布受遗传和环境因素调节，而遗传和环境因素可因人体细胞的遗传和表观遗传学变化而失衡，因此，miRNA检测对于常见的非癌性疾病和癌症诊断必不可少6。研究表明，circ-E2F3在宫颈癌中表达上调7，但其在宫颈癌中的调控机制尚不清楚。据报道，在许多人类疾病（包括癌症）的机制中，circRNA通常充当miRNA海绵调节基因8。根据上述证据，我们推测circ-E2F3通过抑制miR-296影响子宫颈癌的进展。为了验证这一猜想，本研究选择宫颈癌细胞系进一步探讨circ-E2F3在慢病毒感染和质粒转染后对宫颈癌进展的调节作用。1材料与方法1.1实验材料人宫颈癌细胞系CaSki和人宫颈正常上皮细胞 HcerEpic均购自美国模式培养物集存库（ATCC，Bethesda，MD，USA）；circ-E2F3 干扰慢病 毒、miR-296-5p 的 mimic 和 NC mimic 均 购 自Dharmacon公司（Lafayette，CO，USA）；TRIzol试剂盒购自Invitrogen；逆转录试剂盒、SYBR Premix EX Taq试剂盒均购自 Takara；CCK-8 试剂盒购自 Dojindo；BALA/C 裸鼠购自中国医学科学院北京药理学研究所。1.2细胞培养用含10%胎牛血清（Gibco，USA）、100 gmL-1链霉素、100 UmL-1青霉素的 DMEM（Gibco，USA）完全培养基培养细胞，并放置于37、5%CO2、95%饱和湿度培养箱中进行培养，待细胞生长密度为80%左右时进行细胞传代。1.3慢病毒和miRNA mimic转染制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒。按 Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染CaSki细胞，6 h后更换为完全培养基，分别培养48 h和72 h，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，置于0.45 m滤器中过滤，采用超速离心机浓缩，得到高滴度慢病毒浓缩液，分装后置于-80 环境下保存。采用稀释计数法测定各组病毒滴度。第1天将生长状态良好的CaSki 细胞消化计数后稀释至 1104个/mL，以 100 L/孔加入96孔板，每组设6个复孔，置于37、5%CO2培养箱中培养48 h，荧光显微镜观察。按以下公式计算病毒滴度：滴度（PFUmL-1）=细胞数荧光百分比感染复数（multiplicity of infection，MOI）病毒稀释倍数103。将细胞以 3105个/孔的密度接种于 6孔板，待细胞生长密度达 50%时进行转染。设计 2 条 sh-circ-E2F3序列，采用qRT-PCR检测其在CaSki细胞中的干扰效率，筛选出效率最高的序列。sh-circ-E2F3-1：CCCTCCGGCCATTTTTCAGCT；sh-circ-E2F3-2：CGGCGGCCCT CCGGCCATTTT；miR-296-5p mimic：AGGGCCCCC CCUCAAUCCUGU。用qRT-PCR 检测转染效率，用 1 gmL-1嘌呤霉素进行稳转细胞株筛选。1.4qRT-PCR采用 TRIzol法提取总 RNA，使用逆转录试剂盒将 RNA 反转录成 cDNA，体系 20 L（2 g RNA+1 LOligodT，加水至 11 L，0.5 L酶，0.5 L RNA 酶抑制剂，2 L dNTP/2 L buffer/2 L DEPC/2 L水），反应条件：37 15 min，85 5 s。反应体系：SYBR Mix 9 L，正引物 0.5 L，负引物0.5 L，cDNA 2 L，RNase Free ddH2O 8 L；反应条件：95 10 min，95 15 s，60 1 min，连续 40个循环。circ-E2F3、miR-296-5p和GAPDH的引物由上海生工合成（表1）。每个样品设置3个复孔，记录各孔Ct值，以GAPDH为内参，采用2-Ct法计算产物相对表达量。Ct=（实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值）-（对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值）。实验重复3次。1.5CCK-8实验转染48 h后，将各组细胞消化后铺 96孔板，每孔约 2 500个，分别培养 1、2、3、4、5 d，加入 10 L CCK-8 溶液，置于 37、5%CO2、95%饱和湿度培养箱中孵育2 h，酶标仪检测各孔在表1引物序列Tab.1Primer sequence基因名称circ-E2F3miR-296-5pU6GAPDH引物序列F：5-TGTTCCTCCTCCCTCCAAAG-3R：5-GATGCAACGGATTGCGAGG-3F：5-TGCCTAATTCAGAGGGTTGG-3R：5-CTCCACTCCTGGCACACAG-3F：5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3R：5-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3F：5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3R：5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3 444肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4450 nm处的吸光度（OD值），每组取8孔测定值进行统计分析，绘制生长曲线。1.6双荧光素酶报告基因实验通过 CircInteractome（https：/circinteractome.nia.nih.gov/index.html）网站分析得出circ-E2F3最有可能结合miR-296-5p的两个位点。全基因合成miR-296-5p潜在结合位点上下游约500 bp野生型（WT）及结合位点突变型（Mut），克 隆 至 psiCHECK-2 载 体 的 R-Luciferase（hRLuc）3UTR 区域，然后与待测 miRNA 的 mimics/NC 共同转染 CaSki 细胞，转染方法同上。转染48 h后收集并裂解细胞，使用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶（hLuc+）作为内参校正不同样品之间的转染效率，以海肾荧光素酶测定值（relative light unit，RLU）与萤火虫荧光素酶测定值的比值判断目的报告基因的激活程度。1.7裸鼠成瘤实验BALA/C裸鼠共36只，46周龄，体重 1825 g，均为无胸腺、雌性。将裸鼠置于SPF级动物实验室分笼饲养，湿度 60%65%，温度2225，交替给予12 h光照和12 h黑暗环境，提供游离食物和水，适应性饲喂1周后开始实验，实验前观察裸鼠健康状态。本实验过程以及动物使用方案均已获得我院动物伦理委员会的批准。将裸鼠随机分成3组（对照组、sh-NC组、sh-circ-E2F3组），每组12只。分别取1106个稳转细胞作为对照组和sh-circ-E2F3转染组、sh-NC组和sh-circ-E2F3组，PBS清洗 2次，用 50 L生理盐水重悬，加入 50 L Matrigel Matrix，混合均匀后进行皮下注射，观察并记录肿瘤体积。移植瘤体积（V）=（AB2）/2，其中A为长径，B为短径，体积单位为mm3，绘制每个时间点的平均肿瘤体积。30 d后采用二氧化碳窒息法处死裸鼠，取出瘤体测量肿瘤质量并拍照。所有动物实验均按照 实验动物管理条例 的原则和程序进行。1.8 统 计 学 分 析 所 有 数 据 均 采 用 SPSS 21.0（SPSS，Inc，Chicago，USA）统计软件进行处理。计量资料采用均数标准差的形式表示，癌组织及癌旁组织的比较采用配对t检验，其他两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson相关性分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1sh-circ-E2F3 抑制宫颈癌细胞增殖qRT-PCR 结果显示，与 sh-NC 组相比，sh-circ-E2F3-1组、sh-circ-E2F3-2组circ-E2F3表达水平均明显降低（P0.01），且 sh-circ-E2F3-2 组 低 于 sh-circ-E2F3-1组（图1），因此选用sh-circ-E2F3-2进行后续实验。将转染 sh-NC和 sh-circ-E2F3-2的 CaSki细胞用嘌呤霉素筛选稳转细胞株，研究 circ-E2F3对宫颈癌增殖、迁移和侵袭的影响。CCK-8实验结果显示，与sh-NC组相比，sh-circ-E2F3组细胞活力显著降低（P0.01）（图2）。2.2circ-E2F3抑制miR-296-5p表达为了揭示circ-E2F3调控宫颈癌的机制，本研究使用CircInteractome 和 miRDB 数据库来预测被 circRNA 结合的miRNA，结果表明，circ-E2F3具有miR-296-5p保守的靶区，且得分较高（图3）。为了验证circ-E2F3和miR-296-5p的相互关系，本研究对CaSki细胞进行了双荧光素酶报告基因分析，结果表明 miR-296-注：与sh-NC组比较，*P0.01。Note:Compared with the sh-NC group,*P0.01.图1qRT-PCR检测circ-E2F3的干扰效率Fig.1Interference efficiency ofcirc-E2F3 detected by qRT-PCR注：与sh-NC组比较，*P0.01。Note:Compared with the sh-NC group,*P0.01.图2sh-circ-E2F3对HcerEpic细胞增殖的影响Fig.2Effects of silencing circ-E2F3 on the proliferation of HcerEpic cells 445肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.45p mimic可显著降低 circ-E2F3-WT的荧光素酶活性，而circ-E2F3-Mut的荧光素酶活性没有改变，提示 circ-E2F3 与 miR-296-5p 可能存在直接的相互作用（图4）。qRT-PCR检测CaSki细胞及HcerEpic细胞中miR-296-5p的表达，发现沉默circ-E2F3可显著增加miR-296-5p的表达，过表达circ-E2F3可显著降低CaSki细胞中miR-296-5p的表达（图5），表明circ-E2F3可以抑制宫颈癌细胞系中miR-296-5p的表达。2.3sh-circ-E2F3抑制宫颈癌移植瘤的生长为了研究 circ-E2F3对体内肿瘤生长的影响，我们将转染sh-NC和sh-circ-E2F3载体的CaSki稳定细胞株分别接种于裸鼠皮下，4周后取瘤，对肿瘤大小及质量进行分析发现，与sh-NC组相比，sh-circ-E2F3组肿瘤体积和质量均显著降低（P0.01）（图6）。3讨论宫颈癌是一个复杂的病理过程，宫颈癌细胞的增殖和凋亡对病程发展起着重要作用9。本研究结果显示，circ-E2F3 在宫颈癌组织和细胞中表达上调。Yao等10发现，过表达Gas5可减弱宫颈癌细胞的恶性行为，并在 Gas5过表达细胞中观察到 circ-E2F3低表达，与本研究结果相符合。此外，本研究发现，干扰circ-E2F3表达可抑制宫颈癌细胞增殖。有研究报道，针对circ-E2F3的siRNA可以抑制肠道细胞增殖、迁移和侵袭7。有研究发现，circ-E2F3调节基因的水平决定了细胞周期进程以及DNA合成速度，从而决定了细胞增殖速度11。本研究结果显示，在沉默 circ-E2F3的裸鼠中，Ki67和 CD31表达水平显著降低，肿瘤体积缩小，进一步表明沉默circ-E2F3 可以抑制宫颈癌的发生、转移和血管生成。Parida等12发现，在异种移植瘤模型中，肿瘤增殖呈剂量依赖性降低，其特征是肿瘤质量和体积降低以及Ki67表达显著下调，而CD31特异性染色减少表明肿瘤血管生成减少。此外，Wan等13研究发现，敲除E2F3会消除HOXB9对子宫内膜癌细胞的促迁移能力，这与我们的发现是一致的。此外，已知miR-296-5p靶向转录激活因子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3），而 miR-296-5p通过下调信号转导子和STAT3抑制食管鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移14。研究表明，癌症患者注：与sh-NC组比较，*P0.01；与oe-NC组比较，*P0.01。Note:Compared with the sh-NC group,*P0.01;Compared with the oe-NC group,*P0.01.图5在宫颈癌细胞中过表达circ-E2F3和沉默circ-E2F3Fig.5Circ-E2F3 was overexpressed and silenced in cervical cancer cells图3circ-E2F3上的miR-296-5p结合位点Fig.3miR-296-5p binding sites on circ-E2F3注：在 CaSki 细胞中分别转染 NC mimic+circ-E2F3-WT、miR-296-5p mimi+circ-E2F3-WT、NC mimic+circ-E2F3-MUT 和 miR-296-5p mimic+circ-E2F3-MUT后检测相对荧光素酶活性。与mimic-NC组比较，*P0.01。Note:After transfection of NC mimic+circ-E2F3-WT,miR-296-5p mimic+circ-E2F3-WT,NC mimic+circ-E2F3-MUT and miR-296-5p mimic+circ-E2F3-MUT in CaSki cells,detect the relative luciferase activity.Compared with the mimic-NC group,*P0.01.图4各组细胞相对荧光素酶活性Fig.4The relative luciferase activity of cells in each group 446肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4体内STAT3的激活可以加速肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成15。高水平的组成型活性STAT3是各种上皮细胞恶性肿瘤（例如宫颈癌）的特性16。STAT3是一种致癌基因，在约 70%的人类癌症中表达上调。然而在致癌信号的刺激下，STAT3会被持续激活，以活化状态恒定存在于细胞核中，持续激活靶基因，促进肿瘤细胞增殖17。此外，本研究发现 circ-E2F3 可以下调 miR-296-5p 在宫颈癌中的表达。有研究表明，过表达miR-210可诱导E2F3表达下调，而沉默miR-210则可 上 调 E2F3 的 表 达18。Dong 等19证 明，circ_0076305 可以通过抑制 miR-296-5p 来调节非小细胞肺癌中 STAT3的表达和顺铂耐药性。阻断细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）的合成会导致细胞生长阻滞，并且CyclinD1会延缓G1期进程，在宫颈癌的进展中发挥重要作用20。当 CyclinD1蛋白表达水平发生改变时，STAT3的磷酸化也被抑制21。目前的研究证明，circ-E2F3可抑制miR-296-5p表达，高水平的 circ-E2F3 可能是调节宫颈癌进展的重要指标。本研究有助于探索不同的宫颈癌检测指标，并为宫颈癌的治疗和预防提供理论依据。然而，仍然有必要探究circ-E2F3的相应浓度以判断宫颈癌的进展，而 circ-E2F3是否可用于预防和预测宫颈癌的发生还有待进一步阐明。综上所述，circ-E2F3 可通过抑制 miR-296-5p促进宫颈癌的发展，高水平的 circ-E2F3可能是判断宫颈癌进展的有效指标。参考文献1 KOH W J,ABU-RUSTUM N R,BEAN S,et al.Cervical cancer,version 3.2019,NCCN clinical practice guidelines in oncology J.J Natl ComprCancNetw,2019,17(1):64-84.DOI:10.6004/jnccn.2019.0001.2 LI B H,GUO X D,LI N,et al.WNT1,a target of miR-34a,promotes cervical squamous cell carcinoma proliferation and invasion by induction of an E-P cadherin switch via the WNT/-catenin pathway J.Cell 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2023,Vol.13,No.4cers12041037.10YAO T T,LU R B,ZHANG J,et al.Growth arrest-specific 5 attenuates cisplatin-induced apoptosis in cervical cancer by regulating STAT3 signaling via miR-21J.J Cell Physiol,2019,234(6):9605-9615.DOI:10.1002/jcp.27647.11BERTOLI C,SKOTHEIM J M,DE BRUIN R A M.Control of cell cycle transcription during G1 and S phases J.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(8):518-528.DOI:10.1038/nrm3629.12PARIDA S,PAL I,PAREKH A,et al.GW627368X inhibits proliferation and induces apoptosis in cervical cancer by interfering with EP4/EGFR interactive signaling J.Cell Death Dis,2016,7(3):e2154.DOI:10.1038/cddis.2016.61.13WAN J H,LIU H Y,FENG Q L,et al.HOXB9 promotes endometrial cancer progression by targeting E2F3 J.Cell Death Dis,2018,9:509.DOI:10.1038/s41419-018-0556-3.14WANG Z Z,LUO Y R,DU J,et al.miR-296-5p inhibits cell invasion and migration of esophageal squamous cell carcinoma by downregulating STAT3 signaling J.Eur Rev Med Pharmacol 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