生化教案2.doc

牛血清醋酸纤维素薄膜电泳
一、 目的要求
1. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理及操作过程。
2. 了解牛血清蛋白质的各种成分。
3. 熟悉牛血清中各种蛋白质相对含量的测定原理和方法。
4. 熟悉分光光度计的工作原理及使用方法。
二、 实验原理
1. 电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
2. 醋酸纤维素薄膜
醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜,待溶剂蒸发后则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。本实验采用醋酸纤维素薄膜作为介质。
3. 蛋白质
蛋白质是由氨基酸组成的，其分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中尚有一些解离基，作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。 凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。蛋白质是两性电解质，在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。
血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组成、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH=8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。本实验采用pH=8.6的巴比妥-巴比妥钠溶液作为电泳的缓冲溶液。
蛋白质名称
等电点（PI）
相对分子质量
白蛋白
4.88
69000
α1-球蛋白
5.06
200000
α2-球蛋白
5.06
300000
β-球蛋白
5.12
90000~150000
γ-球蛋白
6.85~7.50
156000~300000
4.分光光度计的工作原理
溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---比耳定律。
当入射光，吸光系数和溶液液层厚度不变时，透光率或吸光度只随溶液浓度变化而变化。因此把透过滤液的光经过测光系统中的光电转化器，将光能转化为电能，就可以在测光系统的指示器上显示出相应的吸光度和透光率。
在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。本实验采用分光光度计测定各种蛋白质含量。

三、 实验仪器与试剂
1. 实验仪器
电泳仪、点样器、分光光度计、剪刀、滤纸、镊子、培养皿、试管架、试管、洗耳球、吸量管、玻璃板
2. 实验试剂
巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克，溶于少量蒸馏水中，定容至1000毫升。
染色液：称取氨基黑10B 0.5克，加入蒸馏水40毫升、甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混匀，保存备用。
漂洗液：量取95%乙醇45毫升，冰醋酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，保存备用。
NaOH溶液（0.4N）：称取NaOH 16克，用少量蒸馏水溶解后定容至1000毫升。

四、 实验步骤
1.浸泡醋酸纤维素薄膜
选择质匀、孔细的醋酸纤维薄膜，在无光泽面的一端1.5 cm 处，用铅笔轻画一横线作为加样线并编号，然后置于装有pH8.6的巴比妥缓冲液中，并使之完全浸没，选取在15~30秒内迅速润湿且表面无斑点的醋酸纤维素薄膜，浸泡约15分钟。
2.点样
用镊子从缓冲液中取出醋酸纤维薄膜置洁净的滤纸上吸去多余的水分，使醋酸纤维薄膜既保持湿润状态又无明显的水分，注意不能吸得太干，以免影响导电，导致电泳图谱有条痕，亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来，导致电泳图谱分离不齐。

将醋酸纤维薄膜置于洁净的滤纸上，无光泽面向上。将血清均匀涂抹于点样器上，然后垂直印在点样线上，停留2-3秒待血清完全渗入后移开，形成一条粗细宽窄一致的血清线。注意点样时不能太过用力。
3. 电泳
将点样好的薄膜用镊子迅速平贴在电泳槽的滤纸桥上，并使点样端贴在阴极上，无光泽面向下。为了使膜条与电场平行,还应把膜条与电极之间压严（不能有气泡），使膜条绷直，中间不下垂。放好后盖好电泳槽盖，平衡10分钟后通电，电压可选择95V左右，电泳50min左右。后关闭电源。在电泳过程中注意观察电流的变化。

4.染色与漂洗
将电泳好的薄膜取出，放入染色液中浸泡约5分钟。染色过程中可以轻轻抖动培养皿以使染色更加充分、均匀。注意不要让薄膜重叠。
染色完毕后，用镊子取出薄膜并立即浸泡于漂洗液中，更换漂洗液，漂洗2~3次，背景完全漂洗净后用滤纸吸干薄膜。漂洗过程中可用镊子夹住薄膜轻轻抖动。漂洗完毕后可看到五条清晰的蛋白质带。
5.洗脱法测定各种蛋白质的相对含量（选做）
挑选所得薄膜中蛋白质区带分离最清晰的薄膜，用剪刀小心剪开五条蛋白质带，另于点样线以下剪一大小与色带相仿的薄膜作为空白对照组。取六支试管，编号。将所得的蛋白质带和无色薄膜分别放入六支试管中，用吸量管吸取4mL 0.4mol/L的NaOH溶液分别加入到每支试管中。在室温中放置30分钟，并不时振荡，直至薄膜带上的蓝色全部脱下。选择波长650nm进行比色。以空白对照组调零，分别读出各个蛋白组分的吸光度。
吸光度总和 T=O.D清蛋白（A）+O.Dα1+O.Dα2+ O.Dβ+O.Dγ
各组分蛋白质的百分数为：清蛋白A= O.D清蛋白（A）/T×100%
α1球蛋白= O.Dα1/T×100%
α2球蛋白= O.Dα2/T×100%
β球蛋白= O.Dβ/T×100%
γ球蛋白= O.Dγ/T×100%
五、注意事项
1.实验中所用的巴比妥缓冲液为神经毒剂，染色液与漂洗液也都有毒性，所以在做实验时一定要戴手套。
2.点样是否成功关系到电泳结果，所以点样时应严格遵循操作步骤，并事先在滤纸上反复练习之后再点样。
3.薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一

六、思考题
1.试简述电泳过程区分五条蛋白带的过程。
2.实验过程中控制电压在一定范围内，若电压过小或过大会对电泳结果产生什么样的影响？引起电泳图谱不整齐的原因有哪些？
3.电泳时，已知A蛋白等电点为x，缓冲液PH为y，如何判断点样端应置于电场的正极还是负极？
4. 利用本次实验课所学知识，分析以下表格中个各蛋白质的混合物在醋酸纤维薄膜电泳实验中的电泳结果？绘图表示并说明原因。
蛋白质
等电点
分子量（KDa）
A
4.5
34.000
B
6.2
60.000
C
8.0
28.000
（注：使用pH7的电泳缓冲液，点样端置于负极）
附注：1.实验结果图示

人血清蛋白各组分的正常值：
清蛋白 57-72%
α1球蛋白 2-5%
α2球蛋白 4-9%
β球蛋白 6.5-12%
γ球蛋白 12-20%

福林-酚法测定蛋白质含量
目的要求
1．掌握福林-酚法测定蛋白质含量的原理及操作步骤。
2．进一步熟悉使用分光光度计的操作。
实验原理
在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物。该复合物随后将磷钼酸-磷钨酸还原，发生显色反应，产生蓝色（钨兰+钼兰）。蓝色的强度在蛋白质浓度为25~250μg/mL之间时与蛋白质的含量成正比。
根据多组标准蛋白质溶液与福林-酚试剂反应后所测得的吸光度，绘制标准曲线。以此便可求出未知蛋白质溶液中的蛋白质含量。
仪器与试剂
仪器：分光光度计、试管与试管架、吸量管与洗耳球等
试剂：
试剂甲：A 液——10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.5 g 酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中。
B液——0.5 g CuSO4·5H2O 溶于100mL 蒸馏水中。
试剂甲即为将两溶液以A：B=50:1的比例混合后所得的混合溶液。
试剂乙：在1.5升的磨口回流瓶中加入100 g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流约10小时。回流结束后加入150 g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟一边驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。注意此时溶液的黄色为亮金黄色，如仍有绿色显现，须再重复滴加液体溴的步骤。将所得溶液稀释至1000mL，过滤后将滤液保存在棕色试剂瓶中。
使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（约加1倍水），使最终的酸浓度为1 mol/L。
标准蛋白质溶液：取结晶BSA溶于蒸馏水，浓度为250 μg/mL 。
未知蛋白质溶液：浓度未知的牛血清酪蛋白溶液，使用时不需要稀释。
实验步骤
将试管标号并按下列顺序加入各试剂

试管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
蛋白质含量/μg
—
25
50
100
150
200
250
—
—
BSA标准溶液/mL
—
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
—
—
待测蛋白质溶液/mL
—
—
—
—
—
—
—
0.5
1.0
蒸馏水/mL
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
—
0.5
—
试剂甲/mL
均加入5mL摇匀，室温下放置10分钟
试剂乙/mL
均加入0.5mL，立即混匀，室温下放置30分钟后比色

选择波长为640nm进行比色，根据所得结果绘制标准曲线，由此可求未知蛋白质溶液蛋白质的含量。也可将数据输入Excel中利用图表得到散点图，并得出线性回归方程，由方程求出未知蛋白质溶液中蛋白质含量。

注意事项
1.严格按照顺序加入试剂，同时注意静置时间
2.试管应洁净干燥
3.加Folin试剂时应迅速混匀，加一管混匀一管，以便在磷钼酸和磷钨酸试剂被破环之前即能发生还原反应
4.注意移液管的操作规范
7.比色皿使用之前要用待测液润洗

思考题
1、Folin 酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？
2.含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂成蓝色反应？
3.结合实验经历，谈谈可以从哪些方面使实验结果更准确。