种牛冻精保存和使用.docx

精液冷冻保存是将精液进行特殊处理，保存在超低温下，以达到长期保存的目的。通常采用液氮（）和干冰（）保存。其最大优点是可长期保存，使用不受时间、地域以及种用雄性动物寿命的限制。可充分提高公牛的利用率。现将冷冻精液保存起来和怎样进行解冻及给母牛输精的有关技术操作介绍如下，供参考。 一、稀释液的配方： 的蔗糖液毫升、甘油毫升、卵黄液毫升。二、稀释方法： 将经过检查合格的精液（活力•以上、精子密度中等）按：倍稀释液进行稀释，其稀释原则应保证每个颗粒精液中所含精子数不少于万个，解冻后呈直线前进运行的精子不少于万个。三、冷冻： 在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面厘米左右，使温度维持在至。将平衡后的精液用滴管按一定量（•毫升）滴于铜纱网、滴完最后一滴停分钟后，当精液颗粒颜色变白时，立即浸入液氮，并将全部颗粒取下，收集于贮精瓶或纱网布袋内，并做好标记，然后立即移入液氮罐中贮存。四、解冻： 将预先配制好的•柠檬酸的溶液毫升，放入干净的小试管中，再置于左右的温水杯中，迅速取颗粒冷冻精液粒放入试管。轻轻摇动至化冻时，从水杯中取出试管，接着检查精液活力，不低于•即为合格品。五、重视保精、快速解冻与镜检 、根据液氮罐的性能要求，定期添加液氮罐内盛装冻精的提筒不能露在液氮面外。、取精时，尽可能用长镊子，切勿将提筒或纱布袋提到临界线以上处（罐顶厘米左右）。、从液氮中取出细管冻精时，要轻轻甩下，将塑料细管的棉塞端放入的温水中，把封口端留在水外•厘米外，待管内精液融化一半时，立即取出备用。、解冻后的精液镜检时，精子的活力不低于•方可用于输精，才能确保正常受精。 、解冻后的精液应立即输配，不宜停放时间过长，应做到现解冻、现输精。六、适时输精 母牛正常排卵是在发情结束后小时，精子在母牛生殖道的存活时间为小时，且还需要小时的获能过程，才能与卵子结合受精。精子分钟就会到达输卵管受精部位，因此，让精子早于卵子到达输卵管受精部位是提高受胎率的先决条件。、适宜的输精时间：是在母牛的发情后期。此时母牛表现：精神平稳，外阴部肿胀消失，阴道不再流出透明液体。直肠检查卵泡胀大，表面紧张，有一触即破之感。此时为最佳输精时机。、适宜的输精部位：是在子宫颈内口厘米处即子宫体基部，过浅易导致精液外流，过深易损伤子宫内粘膜。、适宜的输精方法：直肠把握子宫颈输精法。将母牛保定，左手插入母牛直肠轻轻握住子宫颈后端，右手将输精器自阴门向斜上方缓慢插入厘米（以避开尿道口）再改为平插送到子宫颈口，缓慢越过子宫颈管中的皱壁，到达子宫颈基部，徐徐注入精液后，缓缓抽出输精器。、适宜的输精次数：以次为宜。可在发情母牛发情高潮后，黄牛在发情高潮后小时，水牛在发情高潮后小时进行第一次输精，前后间隔小时再进行第二次输精。B1 抽样 B1.1样品的收集 抽样：从受检单位精液库中抽取样品。 送样：将样品送至检验机构。 B1.2抽样方法 B1.2.1正常检查一次抽样方案 各品种投产公牛按牛号顺序排列，由抽样人员现场随机确定取样牛号。 B1.2.1.1各品种公牛抽样头数，按照GB282887中2.1.29条有关标准的规定。 B1.2.2全部取样 对已投产的公牛每头取样。 B1.2.3样品的抽取 凡确定取样的公牛，从其精液贮藏罐中随机抽取一个包装量的精液（不得少于Zo份）。 B1.2.4样品的保存 B1.2.4.1存放冷冻精液的低温容器质量应符合GB5458规定，使用前经过清洗后加入新鲜液氮。 B1.2.4.2取放样品时空中暴露时间不得超过5秒。 B1.2.4.3由专人保管样品，不能脱离液氮，抽样报告单随样品行。 B1.2.4.4样品包装、标记应保持原样。 B2 剂量检查 主要器材 天平（精度木低于干分之一）、小烧杯、剪刀。 B2.1细管 取三支细管冻精，解冻后剪去超声波封口端，把精液挤入小烧杯内（小烧杯的重量应事先称取或事先去掉烧杯重），用天平准确称取精液的重量（W），精液的比重（D=1.04）。每支细管冻精的剂量=W3D。 B2.2颗粒 取三粒颗粒冻精，直接放入小烧杯内用天平准确称取精液的重量（W），每颗颗粒冻精的剂量=W3D。 B3 精子活力的检查 主要仪器和器材显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（181 8）、显微镜保温箱或恒温装置、滴管、2.9柠檬酸钠溶液。 B3.1解冻 细管直接置于37水浴中解冻；颗粒冻精置预先预热至38的内有1.0mL柠檬酸钠解冻液的试管中，水浴解冻，适当摇动，使冻精融化。 B3.2检查 取解冻后精液 50L（微升）置于载玻片上加盖被片立即在200-400倍显微镜下观察活力，环境温度或载物台温度保持38；也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力。每样品观察3个视野，注意不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。 B4 每一剂量呈直线前进运动的精子数 主要器材 血球计数板、血色素管、lmL吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0氯化钠溶液。 B4.1检查方法 颗粒冻精用血色素管准确吸取10微升干解冻的精液，注入盛有0.99mL的3.0氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为100倍稀释的稀释精液；细管精液用血色素管准确吸取20微升干解冻精液，注入盛有0.98mL的3.0氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为50倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满不能有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。 B4.2计算公式 a每剂量中精子数=5个中方格中的精子数（即计数室个中方格的总精子数）10（l立方毫米内的精子数）1000（每毫升精液的精子数）100（颗粒稀释倍数）或 50（细管稀释倍数）剂量值。 上式可简化为 每剂量中精子数=5个中方格精子数500万（颗粒）或 250万（细管）剂量值 b每样品观察上下两个计数室，取平均值，如二个计数室计数结果误差超过5，则应重检。 c每剂量中呈直线前进运动精子数=每剂量中精子数活力（） B5 精子存活率的检查 主要器材 显微镜、恒温箱、吸管、载玻片、盖玻片。 B5.1解冻方法按照B2.1，精子活力的检查按照B2.2。 B5.2存活率的评定 冻精解冻后置37恒温箱中，保存4h检查活力。2、细管冻精的解冻技术和解冻方法在使用细管精液过程中，首先必须按照冷冻精液的规程操作，虽然细管冻精不易受外界环境污染，但标准化、规范化的技术操作也是确保受胎率，避免生殖系统感染病菌的重要措施。具体操作步骤为： 检查细管体细管冻精从液氮中取出后，首先检查细管体是否有裂纹和封口不严的现象，如发现有裂纹者，该支细管冻精应弃之不用，如属封口不严，则解冻时可封口不严的一端朝上放入40左右的恒温水中进行解冻，尽量避免因解冻方法不当而导致解冻后精子活力不强乃至死亡的人为因素。 解冻首先准备40左右的恒温水，恒温容器的准备与颗粒冻精解冻法介绍的相同，细管冻精从液氮中取出后，手拿细管上端(封装精液后封口)，立即放入恒温水中并轻缓游动，以保持其管壁受热均衡。经2030秒钟后即可解冻完毕。目前全国各地较为普遍使用此种解冻方法的解冻效果好且受胎率高，除此种方法外，也有其它几种方法可供参考，但不提倡广泛使用。如搓解冻法将细管冻精放在两手掌间来回反复搓动升温，以达到解冻目的;自然解冻法将细管冻精放在室内常温下，让其自然升温，以达到解冻的目的;人体体温解冻法将细管冻精放在人体贴身衣袋内使其升温，以达到解冻的目的，另外，也有将细管冻精不经过人工解冻过程，而是将冻精装在输精枪上直接输精，靠母牛阴道及子宫颈温度来解冻。除了40恒温水解冻方法外，无论其它任何一种解冻方法，它们完成解冻的时间都较长，违反了快速解冻的原则，所以，不提倡在生产中应用，只宜用于研究解冻方法的对比试验。解冻后的精液如需异地输精，且间隔时间在2小时以上的情况下，其解冻后的精液一定要放在保温杯中方能保存运输。其操作方法是：将解冻后的精液用脱脂棉或卫生纸包好放入塑料袋内置入保温杯中，盖好杯盖即可。 细管剪口冻精解冻后，一定要用消毒纱布抹干细管外围水分，再用细管剪口专用剪刀去人工粉装封口或机械封口一端，切切注意，剪口要正，断面要平整，严禁剪口呈偏斜状，否则输精时会发生精液逆流而影响输精效果。 细管精液装枪将细管输精枪的管嘴拧下，把推杆退到与细管长度大约相等的位置，将细管剪口的一端朝管嘴前端放入管嘴内，一手握细管，一手握管嘴，两手同时稍用力将细管的管嘴内旋转一周，使细管剪口端与管嘴前端内壁充分吻合，以防输精时精液倒流至输精枪管嘴内，然后将细管有栓塞的一端套在推杆上，拧紧管嘴即可输精。B6精子顶体完整率的检查主要器材和材料显微镜、载玻片、血球分类计数器、小吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、甲醇、甘油、所用试剂为ARB6.1试剂配制a.已磷酸盐缓冲液磷酸二氢销(NaH2PO42H2O) 0.55g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2 O) 2.25 g双蒸馏水定容至100mL。b.中性福尔马林固定液40%甲醛HCHO(使用前经碳酸镁中和过滤) 8.0mL磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O) 0.55g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2 O) 2.25 g用0.89%氯化钠约50.0mL溶解后加入8.0mL中和后的甲醛，再加 0. 89%氯化钠溶液定容至100.0mL。c.姬姆萨原液 姬姆萨染料 1.0g甘油(C3H5(OH)3) 66.0mL甲醇(CH3OH) 66.0mL姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放人恒温箱中保温继续溶解4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。d.姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0mL磷酸盐缓冲液 3.0mL蒸馏水 5.0mL现配现用B6.2制片染色a.抹片 取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈35夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干(约5min)。b.固定 在已风干的抹片上滴上l-2mL中性福尔马林，固定15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。C.染色将固定好的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5h后用清水缓缓冲去染液，凉干待检。d.镜检将制备好的抹片在显微镜(l000倍油镜)下观察。e.每样品制作二个抹片，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右二个区)，取二片的平均值，二片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。f.精子顶体完整率计算顶体完整精子数顶体完整率(%)= 100精子总数B7 精子畸形率的检查B7.1制片染色按照B5.2B7.2畸形精子率的计算畸形精子畸形精子率(%)= 100精子总数B8 冻精中细菌数的检查主要器材和材料培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量简、玻律、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅(或微波炉)、培养皿、水浴箱、PH试纸(PH5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、棉绳、纱布、放大镜、牛肉浸膏、蛋白陈、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂粉、 lmol/L NaOH、 lmol/L HCI、蒸馏水。B8.1培养基的配制普通琼脂的制作 牛肉浸膏 5g蛋白胨 10g磷酸氢二钾(K2HPO43H2O) 1g氯化钠(NaCl) 5g用蒸馏水1000mL溶解后加琼脂粉20g加温融解。矫正pH至7.4-7.6并用脱脂棉过滤，分装于三角烧瓶中经高压灭菌(15磅20分钟)。B8.2检查方法灭菌平皿事先标号。细管冻精37水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作挤一滴(第一、第二滴弃用，用第三滴)精液入平皿并准确称重(W1);颗粒冻精以无菌操作直接放入平皿内，把已凉至50左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约15mL，并转动平皿使精液混合均匀，同时作空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置37恒温箱内培养48小时取出，计数平皿内菌落数。每个样品作两个平皿，取平均值，该值就是所检颗粒样品的细菌菌落数。所检细管样品的细菌菌落数一两个平皿菌落的平均值W/W1。C1 种公牛质量 C1.1使用公牛应符合本品种的特征，具有种用价值，其评价为特等、一等标准或评分相当，未经后裔测定的乳用公牛冻精要严格控制使用。 C1.2种公牛体质健壮，无传染病，凡引进的公牛要先隔离检疫，经正式兽医检疫机构证明无下列传染病者才能使用。牛肺疫、布氏杆菌病、牛结核病、牛副结核病、牛白血病、钩端螺旋体、传染性牛气管炎、病毒性腹泻病、胎儿弧菌和阴道滴虫病等。 检疫方法应按照中华人民共和国农业部颁布的有关规定执行。 C1.3公牛外周血检测染色体正常、无遗传病。 C2 公牛鲜精质量 C2.1公牛新鲜精液质量应符合以下标准： a色泽呈乳（灰）白色或淡黄色。 b精子活力65 c精子密度6108mL d精子畸形率15。 附录D 牛冷冻精液制作程序和使用（参考件） D1 采精 采精前洗净公牛下腹部，并用灭菌生理盐水冲洗包皮内腔，进入采精场地对公牛给予充分的性准备时间并空爬l2次，采精频率每星期二次，成年公牛每次可连采两回，但间隔时间要在半小时以上。 D2稀释液配制 D2.1所有器具应洁净并消毒灭菌。 D2.2所用化学试剂（化学纯以上）：柠檬酸三钢、果糖、蔗糖、乳精、甘油，鸡蛋用健康鸡场的新鲜鸡蛋，双蒸水。 D2.3稀释液 细管 A一液：2.9柠檬酸钠液100.0mL，卵黄10.0mL。 二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。 B脱脂牛奶83.0mL，卵黄10.0mL，甘油7.0mL。 颗粒 A12.0蔗糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 B0.11乳糖液75mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 C2.9柠檬酸钠液73.0mL，卵黄20.0mL，甘油7.0mL。 所有稀释液每100.0mL中添加青、链霉素各10万单位，现配现用。 D3 精液稀释与分装 D3.1一次稀释法：将需加的稀释液一次加完。 D3.2二次稀释法：将所加稀释液分为二次添加，首先加入不含甘油的一液，加至稀释总量的一半，降温、平衡后再加足含有甘油的二液。 D3.3添加与精液等温的稀释液时应缓缓加入。 D3.4细管精液的分装 A细管为无毒、耐低温的专用塑料管。 B平衡前在室温下或平衡后在35环境下均可分装，管内需留一定的空隙。 C分装后两端封口应严密。 方装的精液量应符合本标准中5.2.1规定。 D4 降温、平衡 D4.1精液稀释后经出左右逐步降温至35。 D4.2降温、平衡时间为3一4h。 D5 精液冷冻 D5.l冷冻用具需洁净后消毒。 D5.2细管冻精用钢网或细管架熏蒸。 D5.3颗粒冻精用铜网或氟板滴冻。 D5.4液氮为冷源，热平衡温度为-80-110 ，细管熏蒸8min、颗粒熏蒸2min后浸入液氮。 D6 精液解冻 解冻液及解冻方法参照本标准中附录B2规定进行。 D7 输精 D7.1用直肠把握输精法，要求慢插、适深、轻注、缓出。 D7.2注意输精过程中的卫生要求。