医疗器械无菌和初始污染菌检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,医疗器械无菌和初始污染菌检验,用于检验要求无菌医疗器械是否无菌一个方法。若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在该检验条件下未发觉微生物污染。,无菌试验目标：将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染,。,什么是无菌检验法？,医疗器械无菌和初始污染菌检验,2/68,医疗器械无菌检验标准,GB/T 14233.2-,医用输液、输血、注射器具检验方法 第,2,部分：生物学试验方法,年版,中国药典,无菌检验法,医疗器械无菌和初始污染菌检验,3/68,医疗器械无菌试验检验关键点指南（版）,无菌检验是无菌医疗器械产品生产控制过程中一项主要内容。其检验方法、检验结果判定及检验人员业务能力等原因直接影响产品质量和安全。作为无菌医疗器械生产企业，其无菌检验工作应由本企业独立完成。,并要求企业检验人员能当场操作或口述无菌检验过程。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,4/68,培养基,:,是人工配制生物营养物质，即用人工方法将各种物质按各种微生物生长繁殖需要配成一个混合营养物。,微生物,:,必须用光学显微镜或电子显微镜才能观察到微小生物。微生物含有一定形态与结构,并能在适宜环境中快速地生长和繁殖,如细菌、病毒、真菌等。,无菌：,是指某一物体或某一环境中不含有活微生物。,凡能杀灭物体中全部活微生物作用称为,灭菌,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,5/68,细菌：,为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完整细胞核及核膜、核仁，直径普通为,1,m,10,m,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,6/68,真菌：,为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善，有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径普通为,10,m,100,m,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,7/68,医疗器械无菌检验所需设备,超净工作台,医疗器械无菌和初始污染菌检验,8/68,医疗器械无菌检验所需设备,恒温培养箱（最少,2,台）,医疗器械无菌和初始污染菌检验,9/68,医疗器械无菌检验所需设备,压力蒸汽灭菌器,医疗器械无菌和初始污染菌检验,10/68,医疗器械无菌检验所需设备,电热干燥箱,医疗器械无菌和初始污染菌检验,11/68,医疗器械无菌检验所需设备,集菌仪,医疗器械无菌和初始污染菌检验,12/68,医疗器械无菌检验所需设备,生物安全柜,:,（,从试验安全性考虑，提议阳性对照试验使用生物安全柜）,医疗器械无菌和初始污染菌检验,13/68,医疗器械无菌检验所需设备,电子天平,医疗器械无菌和初始污染菌检验,14/68,医疗器械无菌检验所需设备,光学显微镜,医疗器械无菌和初始污染菌检验,15/68,医疗器械无菌检验所需设备,过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）,医疗器械无菌和初始污染菌检验,16/68,无菌检验应在环境洁净度,10 000,级下局部洁净度,100,级单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格恪守无菌操作，预防微生物污染，,预防污染办法不得影响供试品中微生物检出。,单向流空气区、工作台面及环境应定时按,医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法,现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关要求进行验证，其内部环境洁净度须符合无菌检验要求。,无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。,还应该含有高度责任心和严谨细致工作作风。,环境及人员要求,医疗器械无菌和初始污染菌检验,17/68,无菌检验法 环境要求,医疗器械无菌和初始污染菌检验,18/68,隔离系统,无菌检验法 环境要求,医疗器械无菌和初始污染菌检验,19/68,无,菌室在消毒处理完成后，应检验空气中菌落数。,无菌检验法 环境要求,TSA,琼脂,平皿,在,30,35培养48h,证实无菌,取,3,只,放,无菌操作台或超,净,工作台平均位置打开上盖，暴露,30min,后盖好,3,只培养皿上生长菌落数平均应不超出,1,个,无菌试验过程中,也,应检验空气中菌落数，方法,要求,同上,医疗器械无菌和初始污染菌检验,20/68,无菌检验法 试验前准备,器具灭菌,：,与供试液接触全部器具应采取可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内,121,30min,，或置电热干燥箱内,160,2h,。,培养基,：,可按药典中处方制备培养基，亦可使用按该处方生产符合要求脱水培养基。应采取验证合格灭菌程序灭菌。,制备好培养基应保留在,2,25,，普通在,3,周内使用,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,21/68,无菌检验法 试验前准备,配制培养基所需器具,:,医疗器械无菌和初始污染菌检验,22/68,无菌检验法 试验前准备,惯用器具与稀释液,:,医疗器械无菌和初始污染菌检验,23/68,无菌检验法 试验前准备,培养基,:,医疗器械无菌和初始污染菌检验,24/68,无菌检验法 试验前准备,硫乙醇酸盐流体培养基,:,在供试品接种前,培养基氧化层高度不得超出培养基深度,1/5,，不然,须经,100,水浴加热至粉红色消失（不超出,20,分钟）快速冷却,只限加热一次，并应预防被污染。其装量与容器高度百分比应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超出培养基深度,1/2,。,30,35,培养,14,天。,需氧菌生长,厌氧菌生长,医疗器械无菌和初始污染菌检验,25/68,无菌检验法 试验前准备,培养基,:,医疗器械无菌和初始污染菌检验,26/68,无菌检验法 试验前准备,改良马丁培养基：,23,28,培养,14,天,医疗器械无菌和初始污染菌检验,27/68,无菌检验法 试验前准备,培养基,:,医疗器械无菌和初始污染菌检验,28/68,无菌检验用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基无菌性检验及灵敏度检验要求。,无菌性检验,每批培养基随机不少于,5,支（瓶），培养,14,天，应无菌生长。,培养基适用性检验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,29/68,灵敏度检验：,菌种,培养基灵敏度检验所用菌株传代次数不得超出,5,代（从菌种保留中心取得冷冻干燥菌种为第,0,代），并采取适宜菌种保藏技术，以确保试验菌株生物学特征,。,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus),CMCC,（,B,）,26003,铜绿假单胞菌,(Pseudomonas aeruginosa),CMCC,（,B,）,10 104,枯草芽孢杆菌,(Bacillus subtilis),CMCC,（,B,）,63 501,生孢梭菌,(Clostridiumsporogenes)CMCC(B)64 941,白色念珠菌,(Candidaalbicans)CMCC(F)98 001,黑曲霉,(Aspergillus niger),CMCC(F)98 003,培养基适用性检验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,30/68,培养基,应符合,无菌性检验及,灵敏度检验,要求。检验可在供试品无菌检验前或与供试品无菌检验同时进行。,灵敏度检验所用菌种,（药典版要求）,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,枯草芽孢杆菌,生孢梭菌,白色念珠菌,黑曲霉,分别接种各菌种新鲜培养物至对应培养基中培养，将培养物用,0.9%,无菌氯化钠溶液制成菌悬液（浓度小于,100cfu/mL,）,硫乙醇酸盐流体培养基（,12mL,）,9,支：,分别接种小于,100cfu,金葡、铜绿、枯草、生孢各,2,支，另一支不接种做空白对照，培养,3,天,改良马丁培养基,（,9mL,）,5,支,：分别接种小于,100cfu,白念、黑曲霉各,2,支，另,1,支不接种做空白对照，培养,5,天,逐日观察结果：,空白对照管应无菌生长，若加菌培养基管均生长良好，则灵敏度符合要求。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,31/68,无菌检验有两种方法：直接接种法、,薄膜过滤法,直接接种法,:,将供试品或其有代表性各部分直接投放入培养基内培养。,薄膜过滤法,:,含抗菌、抑菌成份供试品会抑制一些微生物生长繁殖,所以用常规方法检验会出现假阴性结果,但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。所以采取薄膜过滤法来去除供试品中可溶抑菌性成份,把细菌等微生物截留在滤膜上,然后再经过处理培养使所含微生物生长繁殖,从而使微生物检出。,方法验证试验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,32/68,当建立产品无菌检验法时，应进行方法验证，以证实所采取方法适合于该产品无菌检验。若产品组分或原检验条件发生改变时，检验方法应重新验证。,验证时，按“供试品无菌检验”要求及以下要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。,方法验证试验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,33/68,菌种及菌液制备：,除大肠埃希菌,（,Escherichia coli,）,CMCC(B)4 4102,外，金黄色葡萄球菌,、,枯草芽孢杆菌,、,生孢梭菌、,白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检验。大肠埃希菌菌液制备同金黄色葡萄球菌。,方法验证试验与灵敏度检验全部菌种区分：,大肠埃希菌代替,铜绿假单胞菌。,方法验证试验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,34/68,取每种培养基要求接种供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最终一次冲洗液中加入小于,100cfu,试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基容器，加入等量试验菌，作为对照。按要求温度培养,3,天,5,天。各试验菌同法操作。,方法验证试验：薄膜过滤法,医疗器械无菌和初始污染菌检验,35/68,方法验证所用菌种,（药典版要求）,金黄色葡萄球菌,大肠埃希,菌,枯草芽孢杆菌,生孢梭菌,白色念珠菌,黑曲霉,分别接种各菌种新鲜培养物至对应培养基中培养，将培养物用,0.9%,无菌氯化钠溶液制成菌悬液（浓度小于,100cfu/mL,）,硫乙醇酸盐流体培养基,8,支：,分别接种小于,100cfu,金葡、大肠、枯草、生孢各,2,支，其中,1,管接入每支培养基要求供试品接种量，另,1,管作为对照，培养,3,天。,改良马丁培养基,4,支,：分别接种小于,100cfu,白念、黑曲霉各,2,支，其中,1,管接入每支培养基要求供试品接种量，另,1,管作为对照，培养,5,天。,方法验证试验：直接接种法,医疗器械无菌和初始污染菌检验,36/68,与对照管比较，如含供试品各容器中试验菌均生长良好，则说明供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用能够忽略不计，照此检验法和检验条件进行供试品无菌检验。如含供试品任一容器中微生物生长微弱、迟缓或不生长，则说明供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采取增加冲洗量，或增加培养基用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行方法验证。,方法验证试验也可与供试品无菌检验同时进行。,方法验证试验：结果判断,医疗器械无菌和初始污染菌检验,37/68,供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装样品。进入无菌检验室样品若有两层（或两层以上）包装，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入试验室。,操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。,供试品无菌检验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,38/68,供试品无菌检验,在,100,级超净台内，酒精灯火焰周围，以无菌操作法将要求量供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基（不少于,15ml/,管）和改良马丁培养基（不少于,10ml/,管）容器中。,正确无菌操作，既不能引入外来菌污染培养物造成假阳性，也要注意接触供试品试验用具温度不可过高以免将可能存在菌烫死。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,39/68,阴性对照,（目标是验证试验是否存在污染）：供试品无菌检验时，应取对应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,阳性对照,（目标是验证试验可靠性，预防假阴性）：应依据供试品特征选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试验菌液制备同方法验证试验，加菌量小于,100cfu,，供试品用量同供试品无菌检验每份培养基接种样品量。阳性对照管培养,48,72,小时应生长良好。,供试品无菌检验,医疗器械无菌和初始污染菌检验,40/68,无菌检验法,-,直接接种,法,供试品数量：同一批号,3,个,11,个单位供试品,优先采取将供试品或其有代表性各部分直接投放入培养基内培养。,如：棉签、导尿包中导尿管、注射器中液体等,医疗器械无菌和初始污染菌检验,41/68,无菌检验法,-,薄膜过滤法,年版,中国药典,要求,:,只要供试品性状允许，应采取薄膜过滤法。供试品无菌检验所采取检验方法和检验条件应与验证方法相同。,在蠕动泵作用下，被测产品经过装有带空气过滤器针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，免去了通常膜转移过程中易产生污染。,无菌检验法中薄膜过滤法所用滤膜孔径应小于,0.45m,，直径约为,50mm,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,42/68,水溶液供试品,取要求量供试液，直接过滤，或混合至含适量稀释液无菌容器内，混匀，马上过滤。,供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为,100ml,，总冲洗量不得超出,1000mL,，以免滤膜上微生物受损伤。,无菌检验法,-,薄膜过滤法,冲洗后分别将,100mL,硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入对应滤筒内，培养。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,43/68,无菌检验法 培养及观察,上述含培养基容器按要求温度培养,14,天。培养期间应逐日观察并统计是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养,14,天后，不能从外观上判断有没有微生物生长，可取该培养液适量,转种至同种新鲜培养基中,，细菌培养,2,天、真菌培养,3,天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,44/68,若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合要求；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合要求，除非能充分证实试验结果无效，即生长微生物非供试品所含。,试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检验，若无菌生长，判供试品符合要求；若有菌生长，判供试品不符合要求。,阳性对照管应生长良好，阴性对照不得有菌生长。不然，试验无效。,无菌检验法 结果判断,医疗器械无菌和初始污染菌检验,45/68,当符合以下最少一个条件时，方可判试验结果无效：,（,1,）无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不符合无菌检验法要求；,（,2,）回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原因。,（,3,）供试品管中生长微生物经判定后，确证是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技术不妥引发。,无菌检验法 结果判断,医疗器械无菌和初始污染菌检验,46/68,试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检验，若无菌生长，判供试品符合要求；若有菌生长，判供试品不符合要求,。,无菌检验法 结果判断,医疗器械无菌和初始污染菌检验,47/68,医疗器械无菌试验检验关键点指南（版）,因为无菌检验时间跨度较长，所以过程统计应能够完整表达试验全过程，对于在试验过程中出现各种情况，均应在统计中客观反应。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,48/68,直接接种法试验结果,医疗器械无菌和初始污染菌检验,49/68,薄膜过滤法试验结果,医疗器械无菌和初始污染菌检验,50/68,无菌检验法 判定,医疗器械无菌和初始污染菌检验,51/68,医疗器械无菌和初始污染菌检验,52/68,试验汇报中宜给出以下信息：,供试品名称；,生产批号和（或）灭菌批号；,供试液制备方法；,接种方式；,每日观察结果,（包含阴、阳性对照）,；,结果判定,试验汇报,医疗器械无菌和初始污染菌检验,53/68,GB 15979-,一次性使用卫生用具卫生标准,初始污染菌,检验,初始污染菌：产品消毒、灭菌前细菌总数，可判明检品受细菌污染程度以及生产单位所用原料、工具设备、工艺流程、生产人员卫生情况，是对检品进行卫生学评价综合依据。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,54/68,部分一次性使用卫生产品微生物学指标要求,产品种类,微生物指标,初始污染菌,cfu/g,细菌菌落总数,cfu/g,或,cfu/mL,大肠菌群,致病性,化脓菌,真菌菌落总数,cfu/g,或,cfu/mL,口罩,普通级,消毒级,10 000,200,20,不得检出不得检出,不得检出不得检出,100,不得检出,尿布等,普通级,消毒级,10 000,200,20,不得检出不得检出,不得检出不得检出,100,不得检出,注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,55/68,初始污染菌,检验,准备：平皿洗净、烘干；牛皮纸包好灭菌,营养琼脂培养基配制、灭菌。,步骤：采样，供试液制备，培养，菌落计数,在,100,级净化条件下用无菌方法打开最少,3,个包装；,从每个包装中取样，准确称取,10g1g,样品；剪碎后加入,200mL,无菌生理盐水中，充分混匀。,液体产品用原液直接做样液。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,56/68,初始污染菌,检验,取上清液共接种,5,个平皿，每个平皿中加入,1mL,供试液,用冷却至,45,左右熔化营养琼脂培养基（,15,20,）,mL,，倒入每个平皿内混合均匀。,待琼脂凝固后翻转平皿置,35 2,培养,48h,后，计算平板上菌落数。,稀释度,5,细菌菌落总数,=5,块平板上细菌菌落总数,（,cfu/g,或,cfu/mL,）,如：取,10g,样品入,200mL,生理盐水中，则稀释,20,倍,当菌落数在,100,以内，按实有数汇报，大于,100,时采取二位有效数字,。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,57/68,初始污染菌,检验,计数方法：,将平板置菌落计数器或从平板后面直接以肉眼用标识笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时能够借助于放大镜、菌落计数器。,菌落特征：,形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色。,边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。,大小差异很大。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,58/68,初始污染菌,检验,假如样品菌落总数超出本标准要求，应将留存复检样品依前法复测,2,次，,2,次结果平均值都到达本标准要求，则判定被检样品合格；其中有任何一次结果平均值超出本标准要求，则判定被检样品不合格。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,59/68,医疗器械无菌和初始污染菌检验相关标准,GB/T 14233.2-,医用输液、输血、注射器具检验方法 第,2,部分：生物学试验方法,年版,中国药典,无菌检验法,GB 15979-,一次性使用卫生用具卫生标准,GB/T 15980-1995,一次性使用医疗用具卫生标准,YY 0033-,无菌医疗器具生产管理规范,医疗器械无菌和初始污染菌检验,60/68,（,1,）培养基配制统计,（,2,）灭菌器、天平等仪器使用统计,（,3,）培养基无菌性检验、灵敏度检验统计,（,4,）菌种购置、传代、使用统计,（,5,）方法学验证统计,（,6,）无菌试验统计,（,7,）灭菌物品制作,（,8,）废弃物处理统计,（,9,）洁净间监测统计,医疗器械无菌检验应有统计,医疗器械无菌和初始污染菌检验,61/68,一、适用范围,二、检验内容,1.,选择无菌检验方法,2.,检验人员 资质,3.,现场察看无菌试验室环境,4.,设备和器具,5.,管理制度、操作规程等相关技术文件,6.,查阅试验统计,三、其它应注意问题,医疗器械无菌试验检验关键点指南（,版）,（,1,）培养基制备,（,2,）供试品无菌检验,（,3,）培养及观察,（,4,）结果判断,（,1,）样品统计,（,2,）灭菌物品制作统计,（,3,）原始试验统计,（,4,）废弃物处理统计,医疗器械无菌和初始污染菌检验,62/68,医疗器械无菌试验检验关键点指南（版）,其它应注意问题还包含：,生产企业应确保样品含有代表性：试验样品应从常规产品中能够代表加工过程和条件批中选择。选择样品是随机。试验样品选择和处理技术应明确，以免对样品上所含微生物数量和种类造成污染和改变。试验样品能够选择制造过程中不合格产品，它们应该代表这个生产批加工程序和条件。用于试验不合格产品应不会影响无菌测试有效性。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,63/68,医疗器械无菌试验检验关键点指南（版）,其它应注意问题还包含：,生产企业对于供试品选取、转移过程要采取预防污染办法，确保试验结果可靠性。选取制作供试品试验样品时，样品包装须完好无损，尤其是只有一层包装样品。进入无菌检验室样品若有两层（或两层以上）包装，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入试验室。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,64/68,参考资料,参考资料一：常见名词解释,参考资料二：无菌室空气中菌落数检验,参考资料三：供试品数量选择,参考资料四：培养基制备,参考资料五：培养基适用性检验,参考资料六：方法验证试验,参考资料七：供试品处理及接种培养基,参考资料八：对照试验,参考资料九：参考标准,医疗器械无菌和初始污染菌检验,65/68,无菌试验关键点,器具灭菌：,全部器具,高,压灭菌,121,30min,，,硫乙醇酸盐流体培养基,:,接种前,培养基氧化层高度不得超出培养基深度,1/5,，,30,35,培养,14,天。,改良马丁培养基：,23,28,培养,14,天。两种培养基要符合,无菌性检验及灵敏度检验,要求；,医疗器械无菌和初始污染菌检验,66/68,无菌试验关键点,供试品包装完好。培养基、供试品消毒后带入无菌室。,采取验证过检验方法（,直接接种法或,薄膜过滤法）在洁净度,10 000,级下局部,100,级区域内，以,无菌操作法,将要求量供试品或供试液分别接种至两种培养基中，同时做阴性对照和阳性对照；按要求温度培养,14,天。逐日观察并统计。如在培养过程中，培养基出现浑浊，培养,14,天后，不能从外观上判断有没有微生物生长，可取该培养液适量转种至,同种新鲜培养基,中，细菌培养,2,天、真菌培养,3,天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,67/68,无菌试验关键点,阳性对照管应生长良好，阴性对照不得有菌生长。供试品管均应澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合要求；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合要求，除非能充分证实试验结果无效，即生长微生物非供试品所含。,出具试验结果后，全部培养物,121,高压灭菌,30,分钟处理。,做好对应试验统计。,医疗器械无菌和初始污染菌检验,68/68,