反转录RT-PCR的相关事项.doc

一、反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
三、操作步骤
1. 总RNA的提取。
2. cDNA第一链的合成（Reverse Transcription）：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（2） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5． 防止DNA的污染：
（1） 采用DNA酶处理RNA样品。
（2） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

RT-PCR引物的选择

　　随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 

　　Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。 

　　基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。 

　　RT-PCR影响因素

　　RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。 

　　◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 

　　◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 

　　◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。
随机引物
适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT
适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异性引物
与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原因
建议
引物
引物特异性差
重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用
巢式PCR
引物浓度过高
适当减少引物浓度
Mg2+浓度
Mg2+浓度过高
适当降低Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反
应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
耐热聚合酶
酶量过多
以0.5U为间隔适当减少酶量
退火温度
退火温度过低
适当提高退火温度或采用二阶段温度法
PCR循环次数
PCR循环次数过多
减少PCR循环次数
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管