植物组织培养基配制.doc

培养基的配制
植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。MS培养基的配制包括以下步骤。
培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ)         mg／L
NH4NO3                      33 000
KNO3                        38 000
CaCl2·2H2O              8 800
MgSO4·7H2O              7 400
KH2PO4                      3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI                       166
H3BO3                       1 240
MnSO4·4H2O               4 460
ZnSO4·7H2O               1 720
Na2MoO4·2H2O            50
CuSO4·5H2O              5
CoCl2·6H2O              5
铁盐(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O              5 560
Na2-EDTA·2H2O           7 460
有机成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇                      20 000
ⅣB
烟酸                       100
盐酸吡哆醇(维生素B6)        100
盐酸硫胺素(维生素B1)        100
甘氨酸                     400
以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。
配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。
配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。
需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5 4～7 0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5 8为止(培养基的pH必须严格控制在5 8)。
培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。
培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。
高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。
第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。
灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。

MS培养基配方:

 成分               分子量           使用浓度(mg/L)
硝酸钾　KNO3           101.11           1900
硝酸铵　NH4NO3         80.04            1650
大量元素         
磷酸二氢钾 　KH2PO4      136.09           170
硫酸镁　MgSO4.7H2O      246.47           370
氯化钙　CaCl2.2H2O      147.02           440
碘化钾　KI              166.01            0.83       
硼酸　H3BO3            61.83             6.2
硫酸锰　MnSO4.4H2O      223.01            22.3
微量元素          
硫酸锌　ZnSO4.7 H2O      287.54             8.6
钼酸钠　Na2MoO4.2 H2O    241.95            0.25
硫酸铜　CuSO4.5 H2O       249.68            0.025
氯化钴　CoCl2.62        237.93            0.025

铁盐             
乙二胺四乙酸二钠　Na2.EDTA     372.25           37.3
硫酸亚铁　FeSO24.7H2O       278.03           27.8
 肌醇                                100
甘氨酸                                2
有机成分           
盐酸硫胺素　VB1                        0.1
盐酸吡哆醇　VB6                        0.5
烟酸　VB5或VPP                       0.5
蔗糖　sucrose            342.31          30g/L

B5培养基的组成和配方
组成成分                    数量(mg/l）
KNO3                        2500
大量元素                
CaCl2·2H2O                  150
MgSO4·7H2O                  250
(NH4)2SO4                     134
KI                         0.75
H3BO4                        3.0
MnSO4·4H2O                   10
微量元素              
ZnSO4·7H2O                   2.0
Na2MoO4·2H2O                0.25
CoCl2·6H2O                 0.025
CuSO4·5H2O                 0.025
铁盐               
Na2-EDTA                      37.3
FeSO4·7H2O                      27.8
 肌醇                              100
烟酸                               1.0
有机成分            
盐酸吡哆醇                         1.0
盐酸硫铵                           10

N6培养基配方
组成成分                    数量(mg/l）
硝酸钾(KN03)                 2830
硫酸铵(NH4SO4)                 463
大量元素              
氯化钙(CaCl2·2HzO)            166
硫酸镁(MgSO4·7H20)             185
磷酸二氢钾(KH2PO4)             400
硫酸亚铁(FeSO４·7H20)          27.8
硫酸锰(MnS04·4H20)             4.4
微量元素            
硫酸锌(ZnSO4·7H20)             1.6
硼酸(H2BO3)                   0.8
碘化钾(KI)                     1.6
甘氨酸                         2  
有机成分                
烟酸                         0.5
盐酸硫胺素(维B1)                1.0
盐酸吡哆素(维B6)

本发明涉及一种适宜蓝莓试管苗增殖的培养基组合物及其方法，
步骤如下：
１）培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
（１）基本培养基：ＷＰＭ，其中白糖３０ｇ／Ｌ，琼脂７～８ｇ／Ｌ，ｐＨ５．３；
（２）诱导培养基：ＷＰＭ＋ＴＤＺ１．０～２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．３～０．５ｍｇ／Ｌ；
（３）叶片诱导培养基：ＷＰＭ＋ＴＤＺ２．０～３．０ｍｇ／Ｌ；
（４）增殖培养基：ＷＰＭ＋ＴＤＺ０．２～０．５ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．１～０．２ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ０．１ｍｇ／Ｌ。
２）、外植体的选取与灭菌；
３）诱导培养：直接从外植体诱导出初代幼芽；
４）在叶片诱导培养基上进行培养，形成胚性愈伤组织或直接形成具备完整植株的再生不定芽；
５）增殖培养。本发明的有益效果是：
１）培养基针对性强、适用性好，芽的诱导率高；
２）增殖系数高，节约了组培成本。
３）遗传性状一致，克服了常规繁殖系数低的缺点。