生物化学和分子生物学：第22章 基因结构与功能分析技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,第二十二章,基因结构与功能分析技术,The Analysis Technology for Gene Structure and Function,DNA,序列测定,基因转录起点及其启动子,基因编码序列,基因拷贝数,基因表达产物,转录水平、翻译水 平,基因功能获得和,/,或缺失策略,随机突变筛选策略,基因结构,功能鉴定,一、基因一级结构解析技术,基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是,DNA,测序（,DNA sequencing,）。,第一节,基因结构分析技术,（一）双脱氧法和化学降解法,Sanger,双脱氧测序（,dideoxy sequencing,）法,CGCATTCCGTTTCGCGAAGATAGCGCG,AACGGCGAACGC,RIPFREDSANGER,安息吧，弗雷德,.,桑格,Ed Young,6,末端终止部位,Maxam-Gilbert,化学降解测序法,G,反应：硫酸二甲酯,G,的,N,7,甲基化，其后断开,C,8,-N,9,，哌啶结合核糖,A+G,反应：甲酸,嘌呤的,N,原子质子化，然后哌啶,置换嘌呤,C+T,反应：肼打开嘧啶环，,碱基片段被哌啶置换,C,反应：,NaCl,存在时，只有,C,可与肼反应，随后被,修饰的,C,由哌啶置换,（二）全自动激光荧光,DNA,测序技术,1.,四色荧光法：,采用四种不同的荧光染料标记同一引物或,4,种不同的终止底物,ddNTP,，最终结果均相当于赋予,DNA,片段,4,种不同的颜色。因此，一个样品的,4,个反应产物可在同一个泳道内电泳。,2.,单色荧光法：,采用单一荧光染料标记引物,5-,端或,dNTP,，所有产物的,5-,末端均带上了同一种荧光标记，一个样品的四个反应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳,原理：,Sanger,双脱氧法,ddG,ddA,ddT,ddC,红色荧光,绿色荧光,黄色荧光,蓝色荧光,电泳,DNA,序列自动分析原理及结果图,读长：,1000bp,准确率：,99.999%,（三）焦磷酸测序：基于发光法测定焦磷酸的测序技术,焦磷酸测序技术操作简单，结果准确可靠，可应用于单核苷酸多态性位点（,SNP,）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、,CpG,甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于,Sanger,法。,（四）循环芯片测序：第二代测序技术,循环芯片测序（,cyclic-array sequencing,）,可实现大规模并行化分析：,40,万,400,万条序列,不需电泳，设备易于微型化,样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本,优势：,技术平台：,454,测序、,Solexa,测序（,Illumina,测序）、,SOLiD,测序等。,可靠读长短，通常在,30,450bp,基本流程：,将基因组,DNA,随机切割成为小片段,DNA,；,在所获小片段,DNA,分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库；,将带接头的单链小片段,DNA,文库固定于固体表面；,对固定片段进行克隆扩增，从而制成,polony,芯片。,针对芯片上的,DNA,，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到,DNA,链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。,（五）单分子测序技术：第三代测序技术,三种主要策略：,通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如,单分子实时技术,（,single molecule real time technology,，,SMRT,）；,利用,DNA,聚合酶在,DNA,合成时的天然化学方式来实现单分子测序；,直接读取单分子,DNA,序列信息。,二、基因转录起点分析技术,转录起点（,transcription start site,，,TSS,）,（一）,cDNA,克隆直接测序法鉴定,TSS,以,mRNA,为模板，经逆转录合成,cDNA,第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在,cDNA,第一链的末端加上,polyC,尾，并以此引导合成,cDNA,第二链。将双链,cDNA,克隆于适宜载体，通过对克隆,cDNA,的,5,-,末端进行测序分析即可确定基因的,TSS,序列。,该方法比较简单，尤其适于对特定基因,TSS,的分析。但可导致,5,-,末端部分缺失，从而影响对,TSS,的序列测定。,（二）,5,-cDNA,末端快速扩增技术鉴定,TSS,常用的技术包括,5,-,末端基因表达系列分析（,5,-end serial analysis of gene expression,，,5,-SAGE,）和帽分析基因表达（,cap analysis gene expression,，,CAGE,）技术。,碱性磷酸酶,烟草酸焦磷酸酶,T4 RNA,连接酶,逆转录酶,（三）数据库搜索,TSS,利用对寡核苷酸帽法构建的全长,cDNA,文库,5,-,末端测序所得的数据信息建立了一个,TSS,数据库（,database of transcription start sites,，,DBTSS,），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种,TSS,测序法，从而实现了一次测试可产生,1107,个,TSS,的数据。,三、基因启动子结构分析技术,（一）,PCR,结合测序技术分析启动子结构,根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以,PCR,法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。简单和直接。,（二）核酸,-,蛋白质相互作用技术分析启动子结构,1.,足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点,足迹法（,footprinting,）是利用,DNA,电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的,DNA,区域。是研究核酸,-,蛋白质相互作用的方法，不是专门用于研究启动子结构的方法。,（,1,）用核酸酶进行足迹分析,酶足迹法（,enzymatic footprinting,）是利用,DNA,酶处理,DNA-,蛋白质复合物，然后通过电泳分析蛋白质结合序列。,常用的酶有,DNA,酶,I,（,DNase I,）和核酸外切酶,III,。,分类：,酶足迹法,化学足迹法,（,2,）用化学试剂进行足迹分析,化学足迹法（,chemical footprinting,）是利用能切断,DNA,骨架的化学试剂处理,DNA-,蛋白质复合物，由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的,DNA,区域，因此在电泳上形成空白区域的位置就是,DNA,结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是羟自由基足迹法（,hydroxyl radical footprinting,）。,2.,电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子,电泳迁移率变动分析（,EMSA,）和染色质免疫沉淀（,ChIP,）只能确定,DNA,序列中含有核蛋白结合位点，故尚需结合,DNA,足迹实验和,DNA,测序等技术来确定具体结合序列。,（三）生物信息学预测启动子,1.,用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子,在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启动子区域的,3,个部分,核心启动子（,core promoter,）；,近端启动子（,proximal promoter,）：含有几个调控元件的区域，其范围一般涉及,TSS,上游几百个碱基；,远端启动子（,distal promoter,）：范围涉及,TSS,上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。,2.,预测启动子的其他结构特征,启动子区域的其他结构特征包括,GC,含量、,CpG,比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。,用于启动子预测的数据库：,EPD,（,eukaryotic promoter databases,）,数据库，主要预测真核,RNA,聚合酶,型启动子，数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实；,TRRD,（,transcription regulatory region databases,）,是一个转录调控区数据库，数据来源于已发表的科学论文。,四、基因编码序列分析技术,（一）,cDNA,文库法分析基因编码序列,cDNA,克隆测序或构建,cDNA,文库是最早分析基因编码序列的方法。全长,cDNA,文库可以通过,mRNA,的结构特征进行判断，,mRNA,的序列基本都由,3,部分组成，即,5,-UTR,、编码序列和,3,-UTR,。,cDNA,末端快速扩增（,RACE,）技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。,核酸杂交法可从,cDNA,文库中获得特定基因编码序列的,cDNA,克隆。,（二）,RNA,剪接分析法确定基因编码序列,高通量分析,RNA,剪接的方法：,基于,DNA,芯片的分析法,交联免疫沉淀法,体外报告基因测定法,选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（,expression sequence tag,EST,）的比较进行鉴定，但这种方法需进行大量的,EST,序列测定；同时由于大多数,EST,文库来源于非常有限的组织，故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。,（三）用数据库分析基因编码序列,在基因数据库中，对各种方法所获得的,cDNA,片段的序列进行同源性比对，通过染色体定位分析、内含子外显子分析、,ORF,分析及表达谱分析等，可以初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。,利用有限的序列信息即可通过同源性搜索获得全长基因序列，然后，利用,NCBI,的,ORF Finder,软件或,EMBOSS,中的,getorf,软件进行,ORF,分析，并根据编码序列和非编码序列的结构特点，便可确定基因的编码序列。,五、基因拷贝数分析技术,分析某种基因的种类及拷贝数，实质上就是对基因进行定性和定量分析，常用的技术包括,DNA,印迹（,Southern,印迹）、实时定量,PCR,技术等。,DNA,印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数,实时定量,PCR,是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同,DNA,测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法,一、检测,RNA,：转录水平分析基因表达,根据分析方法的原理和功能特性，可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。,封闭性系统研究方法（如,DNA,芯片、,RNA,印迹、实时,RT-PCR,等）的应用范围仅限于已知基因。开放性系统研究方法（如差异显示,PCR,、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物,PCR,指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。,第二节 基因表达产物分析技术,（一）核酸杂交法检测,RNA,表达水平,1.RNA,印迹分析,RNA,表达,RNA,印迹被广泛应用于,RNA,表达分析，并作为鉴定,RNA,转录本、分析其大小的标准方法。,2.,核糖核酸酶保护实验分析,RNA,水平及其剪接情况,RNA,酶保护实验（,ribonuclease protection assay,，,RPA,）是一种基于杂交原理分析,RNA,的方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。,RNA,酶保护实验原理,3.,原位杂交进行,RNA,区域定位,原位杂交（,ISH,）是通过设计与目标,RNA,碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测,RNA,的技术，其可对细胞或组织中原位表达的,RNA,进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。,（二）,PCR,技术检测,RNA,表达水平,1.,用逆转录,PCR,进行,RNA,的半定量分析,逆转录,PCR,（,RT-PCR,）一般用于,RNA,的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测,RNA,样品进行半定量分析。,2.,用实时定量,PCR,进行,RNA,的定量分析,实时定量,PCR,是定量分析,RNA,的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对,PCR,反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。,（三）基因芯片和高通量测序技术分析,RNA,表达水平,1.,基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法,基因芯片主要采用,cDNA,芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。,2.,用循环芯片测序技术分析基因表达谱,运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十万到几百万个,DNA,分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。,二、检测蛋白质,/,多肽：翻译水平分析基因表达,（一）蛋白质印迹技术检测蛋白质,/,多肽,（二）酶联免疫吸附实验分析蛋白质,/,多肽,酶联免疫吸附实验（,ELISA,）也是一种建立在抗原,-,抗体反应基础上的蛋白质,/,多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体，,（三）免疫组化实验原位检测组织,/,细胞表达的蛋白质,/,多肽,免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二者原理相同，都是用标记的抗体在组织,/,细胞原位对目标抗原（目标蛋白质,/,多肽）进行定性、定量、定位检测。,（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞,流式细胞术（,flow cytometry,）通常利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。,（五）蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质,/,多肽表达水平,1.,用蛋白质芯片分析蛋白质,/,多肽的表达谱,根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子固定在基片上，用以识别生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质,-,蛋白质蛋白质,-DNA,蛋白质,-RNA,，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质,-,小分子等的相互作用。,蛋白质芯片可用于检测组织细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肽的信息多寡。,2.,用双向电泳分析蛋白质,/,多肽表达谱,双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，还可对差异表达的蛋白质进行鉴定。,一、用功能获得策略鉴定基因功能,基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。,方法：,转基因技术,基因敲入技术,第三节,基因的生物学功能鉴定技术,（一）用转基因技术获得基因功能,转基因技术（,transgenic technology,）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（,embryonic stem cell,），即,ES,细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体,DNA,，随后将受精卵或,ES,细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。,转基因动物（,transgenic animal,）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。,转基因小鼠最为常见。,（二）用基因敲入技术获得基因的功能,基因敲入,（,gene knock-in,）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。,通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。,基因敲入,是基因打靶（,gene targeting,）技术的一种。,基因打靶,是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。除基因敲入外，基因打靶还包括,基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除,等。,基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，但二者的,最大区别,就是基因打靶能去除和,/,或替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。目前，基因打靶已成为研究基因功能最直接和最有效的方法之一。,二、用功能失活策略鉴定基因功能,基因功能失活策略的本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。,方法：,基因敲除,基因沉默,基因敲除,（,gene knock-out,）属于基因打靶技术的一种，其利用同源重组的原理，在,ES,细胞中定点破坏内源基因，然后利用,ES,细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。,（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失,条件性基因敲除,（,conditional gene knock-out,）可以更加明确地在时间和空间上操作基因靶位，敲除效果更加精确可靠，理论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。,Cre/loxP,系统条件敲除靶基因的原理,（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失,1.,用,RNA,干扰技术研究基因功能,2.,用,miRNA,技术研究基因功能,3.,用反义,RNA,技术研究基因功能,4.,核酶（,ribozyme,）技术,利用,RNAi,能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。,通过与,mRNA,不完全互补配对结合而抑制翻译，一种,miRNA,可沉默多个靶基因。,通过反义,RNA,与细胞中的,mRNA,特异性结合，从而抑制相应,mRNA,的翻译。,核酶通过剪切靶,RNA,分子而抑制基因的表达。,三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能,随机突变筛选策略的第一步是通过物理诱变、化学诱变或生物技术产生大量的基因组,DNA,突变。乙基亚硝基脲（,ENU,）,一种化学诱变剂，通过对基因组,DNA,碱基的烷基化修饰，诱导,DNA,在复制时发生错配而产生突变。它主要诱发单碱基突变，造成单个基因发生突变。,ENU,的突变效率非常高。,基因捕获,（,gene trapping,）技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段：将一个含报告基因的,DNA,载体随机插入基因组，产生内源基因失活突变，通过报告基因的表达，提示插入突变的存在以及内源基因的表达特点。对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。,思考题,1.,简述第一、第二和第三代,DNA,测序技术的原理及主要用途。,2.,简述分析基因,TSS,、启动子、编码序列以及拷贝数的主要方法及原理。,3.,如何在转录和翻译水平分析基因的表达特征？,4.,简述鉴定基因功能的主要策略及其原理。,5.,请设计一个综合方案来解析基因的结构和表达特征，并最终鉴定其功能。,