干细胞培养拷贝培训课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞培养拷贝,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞培养拷贝,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞培养拷贝,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞培养拷贝,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞培养拷贝,*,干细胞培养拷贝,2,一、干细胞的概念,干细胞,(stem cells,SC),是一类具有无限或长期自我维持和自我更新能力,(self-renewing),的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。,干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为,“,万用细胞,”,。,干细胞培养拷贝,3,干细胞几个主要特征,具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持自身数目的恒定。,既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。,干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂,干细胞培养拷贝,4,干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（,ES,细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。,干细胞培养拷贝,5,干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将,ES,细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。,在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能,干细胞培养拷贝,6,干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运,保持为干细胞或分化为特定细胞。,干细,胞的分化是不,对称,的分,离,，,当,一,个变两个,的,时,候，其中一,个,能基本保留母,体,的,个,性,，,需要的,时,候，就可以,随时,拿,来,提供源泉。,干细胞培养拷贝,7,二、干细胞的分类,1,、按分化潜能大小来分类,:,全能干细胞（,Totipotent,stem cell,）,：,能分化成所有组织和器官的干细胞，,它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。,多,能干细胞,（,pluripotent,stem cell,）,，,具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。,如,骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞。,专能干细胞（,unipotent,stem cell,）,，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。,干细胞培养拷贝,8,2,、根据来源来分,:,来源于胚胎,-,胚胎干细胞,ESC,（,Embryonic Stem Cell,）,胚胎性生殖细胞,EGC,（,Embryonic Germ Cell,）,来源于成体组织,-,成体干细胞,ASC,（,Adult-derived Stem Cell,）,干细胞培养拷贝,9,胚胎干细胞,指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的细胞。,它可以无限增殖并分化成为全身,200,多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。,干细胞培养拷贝,10,干细胞培养拷贝,胚胎干细胞具有发育成所有细胞、组织和器官的能力。,11,干细胞培养拷贝,12,成体干细胞,是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。,来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。,干细胞培养拷贝,13,3,、根据干细胞组织发生的名称进行分类,:,胚胎干细胞,造血干细胞,骨髓间质干细胞,肌肉干细胞,成骨干细胞,内胚层干细胞,视网膜干细胞,胰腺干细胞,干细胞培养拷贝,14,三、干细胞研究的历史情况,1959,年，美国首次报道了通过体外受精（,IVF,）动物。,60,年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（,embryonic germ cells,EG,细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（,embryonic carcinoma cells,EC,细胞）是一种干细胞。,1968,年，,Edwards,和,Bavister,在体外获得了第一个人卵子。,70,年代，,EC,细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的,EC,细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。,1978,年，第一个试管婴儿在英国诞生。,干细胞培养拷贝,15,1981,年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠,ES,细胞，,并建立了小鼠,ES,细胞体外培养条件。将,ES,细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。,1984-1988,年，,Anderews,等人从人睾丸畸胎瘤细胞系,Tera-2,中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（,embryonic carcinoma cells,EC,细胞）。克隆的人,EC,细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。,1989,年，,Pera,等分离了一个人,EC,细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。,干细胞培养拷贝,16,1998,年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：,James A.Thomson,在,Wisconsin,大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取,inner cell mass,细胞，建立细胞株。,John D.Gearhart,在,Johns Hopkins,大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后,5,9,周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞,(primordial germ cell),，建立细胞株。,干细胞培养拷贝,17,1999,年,12,月，美国科学家在,美国科学院院刊,报告说，,小鼠肌肉组织的成体干细胞可以,“,横向分化,”,为血液细胞。,随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。,1999,年,12,月，干细胞研究进展被,科学,杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。,2007,年日本的,Yamanaka,研究小组和美国的,James Thomson,研究小组,分别获得诱导多能性干细胞,（,induced pluripotent stem cell,，,iPS,细胞）。,2013,年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多能干细胞（,CiPSCs,）。,干细胞培养拷贝,18,诱导多能性干细胞,2006,年，日本京都大学山中伸弥,（,Shinya Yamanaka),发现将四个基因送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新设定变回具全能性的类胚胎干细胞。,2007,年，山中伸弥研究小组和美国波士顿的,Rudolf,Jaenisch,的研究团队分别制造了第二代,iPS,细胞，不但具有和胚胎干细胞几乎一样的基因印痕模式，它们也可顺利地和成鼠形成嵌合体并产生后代。这项结果显示藉由老鼠体细胞,”,返老还童,”,的第二代,iPS,细胞已经跟胚胎干细胞几乎是具有一模一样的特质了,!,干细胞培养拷贝,19,诱导多能性干细胞,2007,年,11,、,12,月山中伸弥研究团队再次成功地利用,3-4,个基因导入人类皮肤细胞并将其成功地转变成,iPS,细胞,!,同时，美国威斯康新的,James Thomson,研究团队利用,4,个基因将人类体细胞重新设定变回干细胞！,2007,年底，美国波士顿,George Daley,实验室利用山中伸弥建立的技术，从病人就诊时取得的皮肤细胞量身订作一个个人的干细胞库，让,iPS,细胞用来治疗人类退化性疾病已经迈入真正的临床新纪元了！,干细胞培养拷贝,20,山中伸弥 约翰,伯特兰,格登,（,Shinya Yamanaka,）,（,John Bertrand Gurdon,）,2012,年的诺贝尔生理学或医学奖获得者,干细胞培养拷贝,21,1962,年出生于日本大阪府，日本医学家，,京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授,人生万事如塞翁失马：,高中热衷柔道，受伤了,10,多次,(,骨折,),，最后阶段学习，考入国立神户大学医学部；毕业后，,蹩脚的整形外科医生,；,1989,年，进入大阪大学研究生院，毕业后，前往美国旧金山的格拉斯顿研究所留学，开始从事老鼠的胚胎干细胞研究。,1996,年回国后,研究陷入停滞,；,1999,年,12,月，成为奈良先端科学技术大学院大学的副教授；,2003,年，日本科学技术振兴机构为他提供了为期,5,年、总额,3,亿日元的研究经费，至此逐步,走向成功,。,荣誉：,2008,年，时代,杂志,“,世界百大影响力人物,”,，罗伯特,科赫奖（德国），科学技术特别奖（日本），邵逸夫生命科学与医学奖；,2009,年，拉斯克基础医学奖；,2011,年，沃尔夫医学奖；,2012,年，芬兰,“,千年技术奖,”,，,诺贝尔生理学或医学奖,。,山中伸弥,干细胞培养拷贝,22,1933,年,10,月,2,日出生于英国，发育生物学家。,格登主要从事细胞核移植和克隆研究。,20,世纪,60,年代所做一个划时代实验：把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。,当,1997,年多利羊诞生之后，这种技术被广为所知,“,克隆,”,。,从科学蠢材,英国皇家学会院士,剑桥大学教授,拉斯克基础医学研究奖,诺贝尔奖获得者,约翰,伯特兰,格登,干细胞培养拷贝,23,至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：,小鼠的胚胎干细胞（,1981,）,金黄地鼠（,1988,）、貂（,1993,）、猪（,1994,，,1997,）、鸡（,1996,）、恒河猴（,1995,）、绒猴（,1996,）。,分离得到人的胚胎干细胞（,1998,），胚胎生殖细胞（,1998,），,目前不断报道成年组织来源的的干细胞及,iPS,。,干细胞培养拷贝,刺激触发性多能性获得细胞,（,Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells,，,STAP,细胞）,-2014,之学术造假,小保方晴子,2014,年,1,月发表于,Nature,，通讯作者为查尔斯,维坎提，若山照彦、笹井芳树和丹羽仁史为共同作者,第一篇论文主要报道了,STAP,现象的发现，即亚致死量的外界刺激，例如弱酸环境，可以将哺乳动物的体细胞重编程为多能细胞，并报道了如何从,STAP,细胞中分离可扩增的多能细胞株。,第二篇论文着重报告利用,STAP,获得的多能细胞可以与胚胎干细胞形成嵌合体，并且对胚胎和胎盘等组织发育有贡献,24,干细胞培养拷贝,1983,年出生,20082009,年，在哈佛大学医学部查尔斯,维坎提（,CharlesVacanti,）教授的研究室中留学工作，从事万能细胞相关研究,2011,年，早稻田大学博士毕业，加入日本理化学研究所若山照彦研究团队,2013,年升任日本理化学研究所发育与再生医学综合研究中心学术带头人,25,小保方晴子,干细胞培养拷贝,造假质疑,可重复性质疑,论文造假质疑,博士论文造假,公布调查结果：,2014,年,4,月，确认造假,论文撤回：,2014,年,7,月,上司自杀：,2014,年,8,月,5,日上午，笹井芳树在日本理化学研究的一栋研究楼内上吊自杀,2014,年,9,月,1,日维坎提教授辞去哈佛大学所属布莱根妇女医院“麻醉、术前和疼痛医药科”主任职务，并休假一年,小保方晴子在监控下重复试验，,2014,年,12,月,19,日，日本理化学研究所公布,STAP,细胞事件,结论，小保方晴子未能制作出这种细胞，实验宣告结束。小保方晴子宣布辞职。,日本早稻田大学于,2015,年,11,月,2,日宣布，正式取消小保方晴子的博士学位。,26,干细胞培养拷贝,第三条泳道与其他部分的颜色深浅不一致,第二篇文章的,Fig.1b,和,Fig.2g,有相似之处,左图为博士论文中照片，表示该细胞原本就处于胚胎状态；右图为,自然,杂志照片，表示在另外一个不同的实验中通过不同的实验刺激而回到胚胎状态,27,干细胞培养拷贝,28,四、,胚胎干细胞的体外培养,（一）技术原理,基本原则：,促进,ES,增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。,有饲养层（,feeder layer,）培养法：,利用饲养层细胞分泌的生长因子,FGF,和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（,LIF,）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。,无饲养层培养法：,利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的,LIF,制备条件培养基。,28,干细胞培养拷贝,29,（二）基本过程,饲养层细胞制备或条件培养基制备,胚胎的制备和培养,胚胎干细胞的分离,胚胎干细胞的培养,胚胎干细胞的鉴定,冻存与复苏,细胞克隆形态,碱性磷酸酶检测,核型的鉴定,分化能力的观察,嵌合能力的测定,干细胞培养拷贝,30,1,、饲养层细胞培养,小鼠胚胎成纤维细胞（,MEF,）,：取孕,12.5-14.5 d,鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。,小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（,STO,）细胞：,按照一般已建细胞系培养方法。,DMEM,加,10%,小牛血清作为培养液。,采用胎数多小鼠一次大量培养,MEF,冻存，用时复苏。,干细胞培养拷贝,31,MEF,和,STO,的优缺点：,MEF,分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比,STO,强，,STO,作饲养细胞时常需在培养基中加入,LIF,。,MEF,不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，,STO,则可长期传代培养。,MEF,不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。,SNL,细胞为转染了,neo,r,抗性基因和,LIF,基因的,STO,细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有,neo,r,抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。,干细胞培养拷贝,32,胚胎干细胞培养过程中，死亡,MEF,或,STO,的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。,不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。,使用前如用丝裂霉素,C,处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素,C,会影响胚胎干细胞的增殖。,干细胞培养拷贝,33,报道的人源性滋养层细胞：,人骨髓来源的间充质干细胞,胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞,新生儿包皮成纤维细胞,成人子宫内膜细胞,人胎盘成纤维细胞,人胚胎干细胞经分化获取的间充质干细胞,干细胞培养拷贝,34,2,、饲养单层制备,MEF,或,STO,连成一片，以含,10,g/ml,丝裂霉素培养液,37,0,C,作用,2-3 h,（如细胞层较薄，也可缩短至,30min-1.5h,），或,射线照射（剂量为,30-100Gy,）。,弃含,丝裂霉素培养液，,PBS,洗,5,次，,射线处理者不用清洗。,消化细胞，制备悬液种植至用,0.1%,明胶处理过（,0.1%,明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温,2h,以上）的培养瓶，种植细胞数：,MEF7.5,10,4,-10,5,个,/cm,2,，,STO,为,5,10,4,个,/cm,2,。,培养至细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞），制备好的饲养单层置培养箱，,5,天内使用，使用前换成干细胞培养液。,干细胞培养拷贝,35,观察：,好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。,MEF,和,STO,产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。,干细胞培养拷贝,36,3,、用于培养胚胎干细胞的条件培养基,直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的,LIF,，使终浓度为,1000U/ml,。,Baffalo,大鼠肝细胞株,BRL,条件培养基（,BRL-CM):,能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子,DIF,。收集培养,72h,的培养液，过滤除菌，用前,6-7,份,+3-4,份胚胎干细胞培养液，再添加,8-10%,胎牛血清。,年龄,2-3,周大鼠心肌细胞条件培养基（,RH-CM,）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集,1-6,代细胞培养液，过滤除菌，用前,6,份,+3,份胚胎干细胞培养液,+1,份胎牛血清。,干细胞培养拷贝,37,4,、胚胎干细胞的分离和培养,（,1,）培养液,配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。,高糖,DMEM,作为基础培养基，葡萄糖浓度为（,4.5g/L,）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。,使用前还要添加,-,巯基乙醇（,0.1mmol/L,）或单硫甘油（,0.15mmol/L,）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。,使用前要添加,15%,胎牛血清：必不可少，但也有缺点。,干细胞培养拷贝,38,血清缺点：,成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；,可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；,含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。,无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。,血清应用之前要进行质量和效率（细胞克隆形成率）检测、血清灭活。,干细胞培养拷贝,39,（,2,）,胚胎干细胞的分离,小鼠：,母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）（远交小鼠制备胚胎）,胚胎采集：取孕,3.5d,（囊胚期或桑椹期）的母小鼠胚胎,胚胎培养：培养皿内制备直径,0.5cm,左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养至囊腔充分扩展（也可直接置饲养层培养）,胚胎干细胞普通分离法：胚胎置饲养层继续培养,2-4d,，消化分离内细胞团（,inner cell mass,，,ICM,），分散为,3-4,个细胞在一起的细胞团,干细胞培养拷贝,40,胚胎早期发生：囊胚形成,（囊胚内细胞团）,干细胞培养拷贝,41,人胚胎干细胞来源,a.,自终止妊娠（,5-9,周人工流产）的胎儿,中提取生殖母细胞,(primordial germ cell),。,Gearhart,法,干细胞培养拷贝,42,b.,取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。,用这种方法，每个胚胎可取得,15,20,个细胞用于培养。,Thomson,法,干细胞培养拷贝,43,c.,通过体细胞核转移技术,（,SCNT,技术）,获取,干细胞培养拷贝,44,干细胞培养拷贝,45,干细胞培养拷贝,46,（,3,）胚胎干细胞培养,有饲养层细胞培养：,将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，,37,0,C,、,5%CO,2,、饱和湿度培养,2d,后出现小集落，并逐步增大，,6-10d,可消化传代，消化时，消化,30s,后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为,2-3min,加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。,无饲养层培养：,明胶包被培养板，条件培养基。,干细胞培养拷贝,47,胚胎干细胞建系及常规培养：,分散克隆培养建系，第一次分散原代克隆后，为避免非干细胞污染，可再进行克隆。,常规培养：生长至,80%,汇合（生长旺盛,2-3d,）时传代，消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照,1,：,3,或,1,：,6,比例转种。,干细胞培养拷贝,48,注意事项：,最初分离的内细胞团以,3-4,个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。,培养条件要始终如一。,为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。,细胞系建成后，应尽快做核型分析，以检测染色体和性染色体组成。,对已建立的永久性和长期培养的细胞系，需不断筛选，去除异常细胞。,干细胞培养拷贝,49,（,4,）培养结果,hES,细胞集落（,10,）,胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。,干细胞培养拷贝,50,5,、胚胎干细胞的冻存和复苏,冻存液：胚胎干细胞培养液,+10%-15%DMSO,。,冻存细胞密度：,10,6,-10,7,个,/ml,冻存与复苏方法同普通细胞。,LIF,条件培养基培养的细胞，仍然用不含,LIF,的胚胎干细胞培养液冻存。,干细胞培养拷贝,51,（三）胚胎干细胞的鉴定,1,、,ES,细胞生物学特性,（,1,）,ES,细胞形态结构及核型,ES,细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。,细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，,核型正常，保留了二倍体性质,。正常,ES,细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。,干细胞培养拷贝,52,（,2,）,ES,细胞生长特性,ES,细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个,ES,细胞和分化的扁平状上皮细胞。,ES,细胞增殖迅速，每,18,24 h,分裂增殖,1,次。,此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。,干细胞培养拷贝,53,人胚胎干细胞,(hES),的特点,形态,：,圆形或椭圆，体积较小，核质比较大，体外抑制分化培养时呈鸟巢状，集落生长并紧密堆积，细胞界限不明显。,干细胞培养拷贝,54,（,3,）,ES,细胞的高度分化潜能,ES,细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分,化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。,在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，,悬浮培养中：“简单类胚体”,“囊状胚体”,细胞分化物。,ES,细胞可进行诱导分化,*用,RA,（维,A,酸或视黄酸）作诱导,90,以上的,ES,细胞,分化为神经胶质细胞，,*聚集培养的,ES,细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩,的心肌细胞。,*将,ES,细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞,组成可代表,3,个胚层细胞。,*用,ES,细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重,构胚和动物个体。,干细胞培养拷贝,55,胚胎干细胞体外诱导分化,外源诱导因子诱导,ES,细胞分化,诱导因子：维甲酸,(RA),、骨形成蛋白,BMPs),、成纤维细胞生长因子,(FGFs),等,转基因诱导,ES,细胞分化,用转基因技术使某种促分化基因在,ES,细胞中表达、调节其分化,与其他细胞共培养诱导,ES,细胞分化,创造细胞分化的微环境,干细胞培养拷贝,56,胎牛血清，骨髓基质细胞共培养,胚胎干细胞,造血细胞,RA,胚胎干细胞,神经细胞,DMSO,胚胎干细胞,肌肉细胞,TGF-,1,VEGF,bFGF,胚胎干细胞,血管和内皮细胞,RA+,胰岛素,+T3,胚胎干细胞,脂肪细胞,BMP-2,BMP-4,胚胎干细胞,软骨细胞,地塞米松，磷酸甘油,胚胎干细胞,骨细胞,基因转染,胚胎干细胞,胰岛素分泌细胞,干细胞培养拷贝,57,（,4,）,碱性磷酸酶和端粒酶活性高,许多资料表明，小鼠、大鼠的,桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（,AKP,）表达,，小鼠的,EC,细胞和,ES,细胞中均含有丰富的,AKP,。而在,已分化的,EC,细胞和,ES,细胞中,AKP,呈弱阳性或阴性,。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚,AKP,呈阳性。因此，,AKP,常用来作为鉴定,EC,细胞或,ES,细胞分化与否的标志之一。,干细胞培养拷贝,58,（,5,）胚胎阶段特异性细胞表面抗原及标志基因的表达,早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（,SSEA-1,）。在胚胎的原始外胚层细胞、,ES,细胞、,EC,细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到,SSEA-1,的表达。小鼠,SSEA-1,的表达自,8,细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚,ICM,细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分,ICM,呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，,SSEA,也常作为,ES,细胞鉴定的一个标志。,标志基因不断被发现：,OCT3/4,、,SOX2+,、,E-RAS,、,FGF,等,干细胞培养拷贝,59,2,、,ES,细胞的全能性,主要体现在以下几方面：,形成畸胎瘤。将,ES,细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；,形成类胚体。培养,ES,细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织；,干细胞培养拷贝,60,直系分化。通过控制,ES,细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，,ES,细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因,NeuroD2,和,NeuroD3,转人,ES,细胞，可使之分化为神经细胞；,形成嵌合体。将,ES,细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（,chimera,），,ES,细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是,检验一个细胞系是否为,ES,细胞的标准,。,干细胞培养拷贝,61,3,、,ES,细胞的鉴定,-,细胞的形态结构,-,核型分析,-,碱性磷酸酶（,AKP,）染色,-,特异表面抗原及标志物检测,-,分化能力检测,体外分化试验,体内分化试验,嵌合体形成试验,核移植试验,干细胞培养拷贝,62,（,1,）,ES,细胞形态学鉴定,依,ES,细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对,ES,细胞进行初步鉴定。,干细胞培养拷贝,63,（,2,）核型分析,ES,细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验,干细胞培养拷贝,64,（,3,）,碱性磷酸酶（,AKP,）染色,原理：,AKP,在碱性条件（,pH9.0-9.6,）下能使孵育液中的,-,磷酸奈酚钠水解，产生,-,奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。,步骤：,生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定,10-15min,水洗滴加孵育液室温,5-10min,水洗,10min,复染（甲基绿等）,10min,。,结果：,未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。,对照：,以已建系,ES,细胞（或小鼠的桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含,-,萘酚磷酸钠为阴性对照。,干细胞培养拷贝,65,（,4,）胚胎干细胞特异表面抗原及标志物的检测,免疫荧光、免疫组化、,Western-blot,、,RT-PCR,、流式细胞仪,胚胎阶段特异性抗原,:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4,Thmoson,分离的,hES,阴性 弱阳性 强阳性,Gearhart,分离的,hES,阳性 弱阳性 阳性,小鼠,ES,阳性 阴性 阴性,鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。,干细胞培养拷贝,66,（,5,）分化能力检测,体外分化能力观察,:,无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：,3d,“,简单类胚体,”,5-10d,“,囊状胚体,”,贴壁细胞为,细胞分化物。,干细胞培养拷贝,67,体内分化能力观察：,ES,细胞接种同一品系小鼠腹股沟或腹腔（,10,7,个细胞）或裸鼠、,SCID,小鼠（,10,6,个细胞）,约,2,周后出现肿块，,4-5,周进一步增大，摘除肿块固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构,干细胞培养拷贝,68,嵌合能力测定：,野灰色小鼠品系（如,129,鼠）,ES,白化体小鼠（,BALB/c,小鼠）或纯合非野灰色小鼠（,C,57,BL/6,小鼠）着床前胚胎内,假孕母鼠子宫内，使之发育成个体,嵌合体小鼠：毛色是,ES,细胞来源品系小鼠和胚胎供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。,除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，或采用,PCR,和小卫星,DNA,方法等鉴定嵌合体。,注射,移植,发育,干细胞培养拷贝,69,（四）胚胎干细胞研究的意义及面临的问题,意义：,ES,细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；,ES,细胞是研究,细胞分化,的理想手段；,ES,细胞是研究基因功能的首选细胞；,ES,细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；,ES,细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源；,ES,细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。,干细胞培养拷贝,70,ES,研究面临的难题：,（,1,）体外培养,ES,细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态，目前在,ES,细胞研究中存在着,建系成功率不高等,问题。,（,2,）,ES,细胞具有,形成畸胎瘤,的可能性,因此在使用,ES,细胞进行治疗前必须首先体外诱导,ES,细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时,自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。,但如何诱导,ES,细胞定向分化成单一类型的分化细胞,尚未完全解决。,必须,寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法,，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。,干细胞培养拷贝,71,（,3,）,ES,细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程,很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官,要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到,器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。,（,4,）,最大的障碍来自于伦理学问题,，特别是,ES,细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类,ES,细胞研究。,干细胞培养拷贝,72,五、,成体干细胞,自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；,外界条件诱导下成体干细胞也可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。,干细胞培养拷贝,73,优点,源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂,理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少,成体干细胞还具有多向分化潜能,干细胞培养拷贝,74,但胚胎干细胞也存在自身的优势：,胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。,虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的,“,效率,”,尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多系分化的结果尚无法肯定。,成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。,干细胞培养拷贝,75,成体干细胞分离纯化,-,利用细胞表面标志分离,单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。,阳性细胞分选法：,从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群；,阴性细胞分选法：,除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。,干细胞培养拷贝,76,技术：,抗体,/,补体介导细胞溶解法：阴性细胞分选法,流式细胞仪分选法,平面粘附分离法,免疫磁珠分离法,阳性、阴性细胞分选法,干细胞培养拷贝,77,免疫溶解法,将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。,细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。,干细胞培养拷贝,78,流式细胞分选术,流式细胞术（,Flow Cytometry,FCM,）是一项综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。已从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。,干细胞培养拷贝,79,免疫磁珠分选技术,用免疫磁珠做细胞分选,(MACS),是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱,/,试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。,干细胞培养拷贝,80,干细胞培养拷贝,81,干细胞培养拷贝,82,干细胞培养拷贝,83,（一）,神经干细胞,（,neural stem cell,NSC,）,1,.,概念：,成体神经系统内存在的一些可分裂的细胞，具有自我更新及分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等的能力，这些细胞称为,2.,存在部位及取材：,嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、下脑室区、纹状体、海马的齿状回、脊髓等脑组织中分布着神经干细胞。,早期胚胎的神经管和神经嵴或胎儿的脑组织,是体外培养神经干细胞的最理想材料来源。,干细胞培养拷贝,84,3.,培养基：,基本培养基是一种特定的,N2,液。添加因子有葡萄糖、人胰岛素、人转铁蛋白、黄体酮、二氢氯丁二胺、硒酸钠、谷氨酰胺和肝素等。,神经干细胞的诱导因子（促有丝分裂原）：,EGF,（表皮生长因子）：调节神经干细胞增殖分化，,bFGF,（碱性纤维母细胞生长因子）：强效有丝分裂原。,4.,生长基质：,多聚赖氨酸或成纤维细胞包被，或不包被。,5.,培养方法及结果：,胰蛋白酶消化或组织块培养。培养,7-10,天可形成神经球性克隆。,干细胞培养拷贝,85,6.,传代：,吹打神经球或消化分散，未分化的神经干细胞一般每隔,7,10,天细胞数可增加一倍，,6-10,天传代一次，一般可传,35,代。,7.,鉴定：,巢素蛋白。,8.,分化及诱导分化：,神经球性克隆，去除生长因子、降低血清浓度（,2-5%,）、悬浮培养均使神经干细胞分化为各种神经细胞；,特殊分化诱导剂诱导分化：维,A,酸（,RA,）、,DMSO,、,-,氨基丁酸、多肽生长因子等,9.,分化细胞以其特殊标记来鉴定,干细胞培养拷贝,86,体外培养的干细胞用于治疗神经损伤和退行性疾病治疗所面临问题：,需要培养足量的神经干细胞,如何标记移植细胞,移植细胞的数量,移植后细胞的存活率,如何鉴别移植的干细胞从移植部位移行至损伤部位,移植后干细胞是如何分化为有功能的神经细胞，并进行修复和功能重建,干细胞培养拷贝,87,（二）造血干细胞,（,hematopoietic stem cell,HSC,）,(1),概念：,是指存在于造血组织内的一类能分化生成各种血细胞的原始细胞。,造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。,干细胞培养拷贝,88,造血干,细胞,淋巴系,干细胞,再生,B,淋巴,细胞,T,淋巴,细胞,NK,细胞,单核,细胞,嗜中性,粒细胞,嗜酸性,粒细胞,嗜碱性,粒细胞,肥大,细胞,血小板,红细胞,巨核细胞,髓红系,干细胞,髓系,干细胞,粒,-,单核系,干细胞,红母细胞,造 血 干 细 胞 的 分 化 途 径,树突状,细胞,？,树突状,细胞,？,干细胞培养拷贝,89,（,2,）造血干,细胞来源,一般造血干细胞来源于：,外周造血干细胞。,骨髓,造血干细胞。,脐带,血造血干细胞。,胎盘来源造血干细胞,干细胞培养拷贝,90,（,3,）造血干细胞的表面标志,人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38、Lin、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA、CD71、,KLS+,等。人类造血干细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。,在干细胞不同的分化阶段，有不同的表面标志表达，故,不同的表面标志已成为区分造血